白僵菌应用研究进展

阙生全，喻爱林，刘亚军，涂叶苟，王小东，熊彩云

(江西省林业科学院，江西 南昌 330013)

白僵菌Beauveria因其较广的寄主范围、较强的致病性和适应性等特点，逐渐成为农林害虫生物防治中应用最为广泛的虫生真菌之一[1]。首个以球孢白僵菌Beauveriabassiana为主要有效成分的生物制剂二十世纪在美国注册登记[2]，而后各类白僵菌生物制剂不断涌现，目前全球以球孢白僵菌为有效成分的制剂占全部真菌杀虫剂的33.9%，我国已登记的11种真菌杀虫剂中有6种为球孢白僵菌产品[3-4]。自2016年国家财政部、国土资源部、环境保护部联合发布《关于推进山水林田湖生态保护修复工作的通知》以来，农林病虫害的环保型防治管理日益受到重视。白僵菌制剂是一种无毒无味、无环境污染，对害虫具有持续感染力的生物农药，符合生态环保要求，常用于农林病虫害防治。目前，白僵菌已经广泛运用于二斑叶螨Tetranychusurticae[5]、烟粉虱Bemisiatabaci[6]、蓟马Frankliniellaoccidentalis[7]、亚洲玉米螟Ostriniafurnacalis[8]、思茅松毛虫Dendrolimuskikuchii[9]等农林害虫防治。

然而白僵菌生物制剂以活体孢子作为有效成分，在野外环境中受气候、地形、植被等多重因素影响，面临着杀虫防病周期长、效果不稳定等问题，给病虫害的防治管理带来较大困难。因此，如何克服白僵菌在防治管理上的弱点，充分发挥其作为环境友好型病原型真菌的优势，已然成为当前亟待解决和攻克的关键问题。本文作者就白僵菌生物学特性、高毒力菌株选育、菌株高毒力稳定性、施菌方式菌药互配等方面研究进行概述。

1 白僵菌生物学特性

1.1 白僵菌的致病性 白僵菌是在自然界广泛存在的子囊菌类虫生真菌，同时还能随着植物的生长进行传播[10]。以有丝分裂孢子进行增殖，其孢子在接触害虫后产生芽管侵入虫体，在虫体内大量繁殖，代谢产物对昆虫体内角质层、细胞膜以及细胞核等细胞器产生不利影响，最终导致害虫因代谢紊乱而死[11-12]。白僵菌可寄生鳞翅目、鞘翅目、同翅目、膜翅目等700多种昆虫和部分蜱螨类，是广谱性虫生真菌[13]。同时白僵菌还具有较强的选择性，对瓢虫、食蚜虻和草蛉等侵染攻击能力较弱，从而有利于保护天敌昆虫，降低对昆虫生态群落的破坏[14]。白僵菌对害虫致病能力受到菌株、宿主及环境因子等影响。白僵菌虽然侵染多种昆虫，但不同菌株对害虫寄生具有一定的专一性[15]。环境条件对白僵菌致病力有一定的影响。曹艺潇和刘爱萍测试了不同温度、湿度下白僵菌对草地螟Loxostegesticticalis幼虫的致病力，结果表明：在温度为26 ℃时的致死中时(LT50)最短，死亡率最高；相对湿度越高，草地螟幼虫死亡率越高，相对湿度为95%时，死亡率达100%[16]。

1.2 遗传多样性 野生型白僵菌本身存在较大的异质性和较高的遗传多样性，对于不同的地理和寄主来源的菌株，其毒力和生物学特性存在较大差异。从法国、哈萨克斯坦、澳大利亚以及我国11个省份共采集了90株球孢白僵菌，分析其遗传多样性和种群遗传结构时，发现不同地区的菌株遗传多样性呈现显著差异，而菌株之间的遗传分化程度和遗传距离与地理位置无关，更多的是受寄主类型的影响[17]。Cruz利用内转录间隔区和β-微管蛋白序列以及扩增片段长度多态性标记，分析了哥伦比亚白僵菌11株菌株的遗传多样性，结果表明通过聚类分析它们菌株之间产生了3个遗传群体，毒力比较结果证明基因相似的菌株组合没有表现出显著的差异，然而基因不同菌株的混合物导致了拮抗作用和协同作用[18]。也有研究显示球孢白僵菌种群遗传多样性随寄主种类增加而增加，如引起小皱蝽Cyclopeltaobscura流行病的球孢白僵菌种群具有较高的遗传多样性[19]。

白僵菌在人工培养施用过程中，菌株毒力会在一定程度上发生变异变化[20-22]。路文雅 等对10株白僵菌毒力的研究表明，不同菌株对昆虫病原线虫的毒力均较弱，但对植物线虫的毒力大小差异显著[23]。在野外的试验中也发现了类似的问题，从松墨天牛Monochamusalternatus幼虫分离得到的2株白僵菌用于对川硬皮肿腿蜂Sclerodermussichuanensis的毒力测定，结果表明其致死率分别为97.14%和40.17%，其毒力相差甚远，表明菌株对不同寄主的致死效果极不稳定[24]。因而，采集菌株应关注寄主特性与生存环境，而在白僵菌制剂的使用上，还要根据病虫害的防治对象，有针对性的筛选高致病菌株，加强对杀虫范围和防病谱的相关研究，如针对刺吸式口器害虫的防治，特定的白僵菌产品已经生产面世，并表现出很好的防治效果[25]。冯树丹 等利用2种交配型(B5和B2)球孢白僵菌-玉米共生体防治亚洲玉米螟，结果表明：共生体(菌株B2)对亚洲玉米螟产卵具有明显的驱避作用，亚洲玉米螟幼虫存活率均显著低于对照组，其中B5组幼虫的存活仅为38.33%，有助于对亚洲玉米螟的可持续生态防治[26]。

2 高毒力菌株选育

由于白僵菌遗传多样且毒力差异大，选育出具有产孢量高、毒力强、见效快的优良菌株对生物防治病虫害尤为重要[27]。目前，对于白僵菌高致病性菌株的选育主要通过自然筛选、人工诱变育种和基因工程等手段。

2.1 自然筛选法 自然筛选法是一种常规选育方法，通过从野外采集白僵菌致死虫体上分离得到自然菌株，根据其产孢量和毒力高低从中筛选具有较强侵染能力的菌种。研究发现，在不同的自然环境中，白僵菌细胞表面结构有巨大差异，同时表现出不同的生物化学性质[28]。自然界中的白僵菌菌种资源极为丰富，这为筛选高毒力菌株提供了便利。利用此方法，研究者已从土壤和不同虫体上分离得到大量白僵菌菌株，并进行了毒性测定等研究[29-30]。

2.2 人工诱变育种 人工诱变育种主要是利用物理诱变因素和化学诱变剂选育高毒力的白僵菌菌株[31-32]。目前，在白僵菌诱变育种方面主要采用的是紫外诱变、离子(N+) 注入诱变等。利用紫外诱变白僵菌，获得了具有较高毒力和稳定性的突变株，其菌株感染烟粉虱、小菜蛾Plutellaxylostella、苜蓿叶象甲Hyperapostica的毒力试验，结果显示突变株致死率均显著高于自然菌株[33-35]。将白僵菌的孢子悬浮液置于紫外灯下进行诱变处理，筛选获得高毒力菌BH01-12，致死率为原始菌株的1.30倍，且经6代继代培养后，无论产孢量还是对美国白蛾幼虫的致病力方面均未下降[36]。

低能离子注入诱变是利用离子束与生物体作用能够产生能量沉积、动量传递、质量沉积等作用，对生物体内的高活性自由基团造成间接损伤，从而诱发碱基的改变[37]。近年来离子注入微生物育种的研究发展非常迅速。蔡守平 等将不同剂量的N+注入球孢白僵菌，从而获得2株具有较高Pr1蛋白酶产量的突变菌株[38]。邓小军 等同样利用低能N+注入诱变技术获得了1株优良菌株，其Pr1蛋白酶活和几丁质酶活性显著高于母菌株，对油茶叶蜂Caliroacamellia、油茶毒蛾Euproctispseudoconspersa均具有较强的致病力[39]。

2.3 基因工程 随着分子生物学的发展，白僵菌致病机理逐渐被人们所熟识。基因工程技术能够对菌株毒力基因进行定位和定向诱变，从而提高病原真菌的致病性，提高杀虫效率[40]。Vip3A是由苏云金芽孢杆菌分泌产生的高效杀虫蛋白，秦毅利用芽生孢子转化体系介导，将Vip3Aa 基因导入球孢白僵菌野生株，筛选获得了1株遗传稳定性高，毒力强的工程菌株[41]。几丁质是昆虫体壁的重要组分，是虫体抵御外界侵扰的机械屏障，郝蕾蕾 等将几丁质酶基因Bbchit1转入野生型球孢白僵菌中，显著提高了菌株几丁质酶的活性，毒力测定发现，改造的菌株对马尾松毛虫具有较强的侵染和致死能力[42]。

随着技术的发展，菌株选育方法日益多样，但仍然存在一定缺点。如自然筛选法虽然最为方便易行，但对白僵菌的自然性状只能筛选，无法改良。同时，自然界菌株来源多样，需要进行大量的生物活性和毒力测定。人工诱变育种在一定程度上改良了自然菌株的生物特性，提高了菌株的产孢量和致病力，但改良菌株在之后的培养过程中常会出现毒力退化和产孢量降低等问题[43]。基因工程虽然为菌种选育提供了更为精确的改良手段，但相关方面的研究进展不够理想，目前还未发现用于生产的工程菌株。选育的菌株经继代培养，常会出现毒力降低等退化症状，故未来要根据具体需要，结合各种选育方法进行菌种选育。同时还需对选育菌株采用适当方式进行菌种保藏，建立标准化的白僵菌菌库。

3 菌株毒力保持

3.1 菌种复壮 目前有关白僵菌培养的基础研究相对成熟，工业生产基料主要是麦麸和碎米，其价格低廉，产孢量大，是目前工业生产的主要培养基料[44]。但由于白僵菌本身的遗传多样性，随着传代次数的增加，其毒力会出现不同程度的下降。研究发现，培养第6代之前基因组DNA变异较小，而在第12代其遗传基因就会发生显著变化，从而显著影响菌剂产品质量[45]。对菌株进行及时更替和复壮成为研究和生产的重点，邹东霞 等通过虫尸复壮法和活虫复壮法对多次转管且保存时间较长的白僵菌株进行复壮，均收到了较好的效果。在虫体上反复接种，也有利于提高白僵菌对虫体的侵染力[46]。此外，转换培养基法也是菌种复壮的一种重要方法，有研究发现利用胶体几丁质培养基培养白僵菌，对退化菌株复壮具有较好效果[47]。白僵菌在工业生产过程中应控制传代次数，及时对弱毒力菌株进行复壮或重新进行菌种采集和筛选，这是保证白僵菌制剂药效的重要手段。

3.2 白僵菌制剂剂型 白僵菌属于中温型的虫生真菌，易在潮湿环境中侵染昆虫，不适的温度或湿度均会影响它对昆虫侵染和致死能力[48]。为克服这一问题，改进白僵菌的施用剂型，改善白僵菌孢子的微环境成为研究关键。白僵菌的剂型是在生产过程中将分生孢子按一定比例与其他组分加工制备而成的产品形式。目前已研制出白僵菌的主要剂型包括乳剂、油剂和混合粉剂等[49]。为了能够有效延长白僵菌孢子活性的载体，不同微胶囊剂不断被研制生产，包裹在孢子外面的胶囊膜能够有效保护白僵菌孢子免受紫外线损伤[50]。而无纺布菌剂作为一种新型白僵菌制剂，由日本日东电工株式会社研制生产，能够有效改善白僵菌孢子的微环境。一旦环境适宜，还能够促进白僵菌继续生长和产孢，在野外应用中也获得了比较理想的效果[51]。虽然白僵菌制剂含孢量大、类型多样，但缺乏相关的应用指导，且作用单一。从目前市售白僵菌制剂的类型和效能来看，新型白僵菌杀虫剂剂型的开发和研究，具有很大发展潜力和应用需求。

4 施菌时期和方式的选择

4.1 施菌时期 大量生物农药在农林业方面广泛使用，虽然有关生物制剂的基础研究较为深入，在室内试验中均取得较好效果，但实际应用经验较为匮乏，加之野外环境复杂多样，面临着防治结果不稳定的问题，因而很难将研究成果付诸于农林业的生产实践中[52]。施药时间是影响白僵菌剂对病虫害防治效果的关键因素之一，黄振华 等通过对从僵死樟萤叶甲虫Atysamarginata上分离得到的白僵菌进行分离扩大培养，然后用含苞量为100亿/g以上的白僵菌菌剂(三级种) 制得粉炮，用于防治樟萤叶甲前两代幼虫，其防治效果在54.2%和81%之间，受施菌时间影响显著[53]。此外，巴永芳 等在运用白僵菌防治玉米螟的试验中发现，在玉米螟卵孵化盛期或低龄期应用白僵菌乳剂进行喷洒能够收到良好的杀虫效果[54]。在对侵染疟蚊Anophelesgambiae幼虫的研究中发现，白僵菌对初龄幼虫相较于老龄幼虫有更高的致死率，但在对小菜蛾的研究中发现成虫更易受白僵菌的侵染致死[55-56]。

4.2 施菌方式 由于防治对象不同，除了要注意施菌时间，施菌方法和方式也会影响白僵菌对病虫害的致死效果[57]。因而要依据防治区植被特点进行有针对性的防治，如农田以喷洒菌液及土壤施菌为主，对于树体高大的林地多选用喷粉机喷菌粉进行害虫防治，能够克服地形地貌影响，增加药效持久性。在对四川省自贡市荣县低山丘陵地带林地马尾松毛虫，就选择飞机喷洒白僵菌进行预防性防治，有效控制了虫口密度和马尾松有虫株数[58]。根据白僵菌具有风扩散和虫体交叉感染的特点，依据具体害虫类型和危害程度采用带状、棋盘式、点块状等防治方式。此外，为了以最低的经济代价换取最优的防治效果，还要注意施菌的具体位置和释放的孢子量，这些因素均会对防治效果产生影响。崔雨虹等通过对玉米不同施用方式的研究发现，对土壤喷施白僵菌乳剂相较于喷施玉米苗叶面，对根部生长有更好的促进作用，且用1×106孢子/mL的白僵菌孢子悬浮液处理土壤相较于其他浓度菌液更为经济、高效[59]。

虫生真菌发挥作用的有效成分主要是孢子和菌丝体等具有生物活性的有机体，发挥作用前需要在一段时间内进行繁殖发育，因而在野外实际使用的过程中极易受到其他生物因素和非生物因素的影响，常出现防治效果不理想的状况，极大限制了白僵菌制剂的大规模使用[60-61]。受客观条件限制，施药时间与方式以及防治对象均是影响白僵菌发挥作用的重要因素，而有关这方面的研究相对缺乏，尚未形成权威可信和细致的操作规范或指导说明。随着无人机等新技术手段的不断运用和发展，白僵菌的施药方式也应随之发生改变。

5 高效低毒菌药复配剂

由于生物农药本身存在见效慢、杀虫不彻底和操作繁琐等问题，且在白僵菌生物制剂的实际应用中，将不可避免的与各类杀虫剂、除草剂应用在同一片土地的植被上。虫生真菌与传统农药搭配使用不仅可以提高对农林病虫害的防治效果，还可以降低传统农药的使用量，进而降低病虫害产生抗性的风险，降低对自然环境的破坏。但菌剂与低毒农药混用的前提是二者必须具有较好的相容性[62-63]。研究发现，白僵菌孢子与除草剂、杀虫剂相容较好，而杀菌剂会抑制白僵菌孢子的萌发和侵染[64-67]。曹伟平 等通过对球孢白僵菌与11种新型化学杀菌剂相容性的研究发现，对小菜蛾有一定杀虫活性的吡唑醚菌酯，与白僵菌可以同时使用，达到病虫害同时防治的目的[68]。相较于白僵菌孢子和各种化学试剂的融合，与其他菌剂混合使用效果更为环保和有效。有研究发现运用苏云金芽孢杆菌和白僵菌综合防治马铃薯甲虫能够取得很好的防治效果[69]。鉴于生物农药药效慢且不稳定的天然缺陷，而白僵菌与其他低剂量化学农药联合使用，既保证了速效性，又保证了持效性。但在我国生产的生物制剂中，混合制剂相对较少，而且缺乏测定评价毒效的相关标准。在实际应用中，开发菌药复配剂是充分发挥菌剂杀虫作用的一个重要途径。

6 展望

白僵菌虽然具有分布广、寄生害虫种类多、对害虫天敌无害、生产成本低等诸多优点，但从选种、培育到利用生产的白僵菌菌剂在自然环境中进行病虫害防治，仍然面临诸多问题。从生物防治的发展趋势来看，白僵菌作为一种重要的昆虫病原真菌，其制剂的应用开发潜力巨大。但由于复杂多样的自然环境为病虫害提供天然庇护所，单一利用白僵菌生物制剂往往很难收到很好的防治效果，未来需要结合多种防治措施对病虫害进行防治。以松墨天牛的防治为例，除了白僵菌能够在一定程度上控制虫害，天敌捕杀和引诱剂诱杀均是有效环保的防治措施[70-72]。LI Huiping等利用肿腿蜂携带白僵菌对桑天牛进行防治试验，发现这种联合寄生的方法较单一方法能够得到更好的防治效果[73]。白僵菌对害虫的防治效果，是评价菌剂高效与否和施用策略优劣的最终标准。目前建立的药效试验准则多为农业领域，如针对蔬菜烟粉虱、十字花科蔬菜蚜虫、蘑菇菌蛆和害螨等的防治。但由于白僵菌寄主多样、生物特征差异大，很难针对白僵菌建立一套完整的评价体系和标准。随着白僵菌对特定虫害的精准化使用，建立白僵菌防治虫害的评价标准也是未来的研究方向。邱萍 等在对白僵菌防治马尾松毛虫效果的研究中，通过比较防治前后马尾松毛虫虫口密度和有虫株率来评价防治效果[74]。

未来对于白僵菌生物制剂的应用研究，除了选育更多的优良菌种和开发新剂型，同时还要建立白僵菌菌库，绘制精准防病谱，建立科学的施菌指南。此外，研究白僵菌的生态作用，注重多种措施的综合防治，也是推动生防发展的一个重要研究方向。