胶原蛋白发展进程中的3个问题

吴琎，徐雨情，王永久，段蕊

（淮海工学院海洋生命与水产学院，江苏连云港222005）

胶原蛋白指的是生物体内细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的一类结构蛋白质，是一类外观呈白色、不透明、没有支链的纤维型蛋白质，它一般分布于动物肌腱、韧带与软骨、皮肤以及一些结缔组织中，是现今哺乳动物各组织器官中含量最为丰富、覆盖面积最大的一种蛋白质，其分子中通常最少有1个由α链构成的三股螺旋构象的结构域，生物学上也称胶原域，是高度保守的特征性结构。胶原蛋白在生物体内作为一种重要的功能性蛋白质，在细胞再生、保证皮肤、骨骼发挥正常功能中发挥重要作用，同时也与动物的细胞分化、细胞衰老、关节润滑及疾病产生息息相关[1]。

胶原蛋白产品的研发使用开始于日本，起初有关这一新兴产品功效的争议不断，这引起了日本各界的广泛关注，由此也推进了大量科研成果的产生。从备受质疑到被少数人接受直至被消费者广泛认可，胶原蛋白已经成为日本人民日常使用的食品添加剂，在食品领域得到了广泛的应用[2]。就全球领域而言，胶原蛋白早已不再单一应用于食品行业，它被广泛使用于于医疗药品、化妆品及包装材料等各领域[3]。我国从2005年开始兴起了一股胶原蛋白热潮，目前的胶原蛋白产品市场年需求量已经达到了15 300 t，发展速度与规模与日俱增，但在消费者及科研人员中仍存在着较大的争议。这主要由于中国胶原蛋白行业起步较晚，市场教育不到位，行业统一标准尚未制定等原因所致。同时，国内的众多消费者在对胶原蛋白的认知与消费理念上还与日美各国存在着一定的差距，这些综合问题导致了中国的胶原蛋白行业发展存在着各类不规范现象，使得胶原蛋白产业整体发展相对缓慢。

1 产品称谓界定

胶原蛋白产业的发展中有一些问题需要明确，首先是胶原蛋白的定义与界定[4]。胶原蛋白是一类物质，其结构有相似之处，但应用领域不同，其具体定义并不完全相同，目前市场上的胶原蛋白主要有两类产品。

第一类，应用于生物学及医学领域，此类胶原蛋白产品一般是指从生物体中提取得到的具有完整三螺旋结构和能很好发挥细胞间质功能的产品（不变性胶原蛋白产品）[5]，此类产品目前应用于医疗器械、细胞培养等领域，应用者多为生物领域专业人员。第二类产品是在食品、保健品、化妆品等领域的胶原蛋白，此类产品是以动物皮肤、骨骼等为原料，经提取、酶解等工艺制备的小分子肽类产品[6]。此类产品是随现代酶制剂工业的发展而发展起来的，目前广泛用于食品配料、口服液、面膜、保健食品中，与消费者联系最为密切，也是广受诟病的胶原蛋白制品，目前关于胶原蛋白的负面报道均来自于此类胶原蛋白产品，应用者多为普通民众。

由于胶原蛋白在不同领域代表了不同的产品，因此在称谓使用过程中应该注意区分。特别是政府部门在标准制定以及行业协会在产品名称使用方面要区分开来。如目前我国比较普遍采用的胶原蛋白产品标准分别有：QB 2732－2005《水解胶原蛋白》、GB/T 22729－2008《海洋鱼低聚肽粉》、SB/T 10634－2011《淡水鱼胶原蛋白肽粉》，还有一些企业标准如Q/JYB 0065 S-2010《复配胶原蛋白粉》。

就 QB 2732－2005《水解胶原蛋白》和 SB/T 10634－2011《淡水鱼胶原蛋白肽粉》而言，在其名称上均可以明确的看出其产品标准是针对以富含胶原蛋白的动物皮肤、骨骼及明胶等为原料，经提取、酶解等工艺制备的肽类产品。GB/T 22729－2008《海洋鱼低聚肽粉》也同样声明了其产品为肽类制品。以上标准在使用上较好的避免了两类胶原蛋白产品的混淆。

但是一些企业标准如Q/JYB 0065 S-2010《复配胶原蛋白粉》，则可能产生歧义。从称谓上看，容易被误认为其产品为生物学意义的胶原蛋白，但从内容上看其主要是胶原蛋白肽。

建议如果产品生产工艺过程中有超过50℃的保温以及酶解工艺，其产品在名称上需要冠以“胶原蛋白肽”称谓，明确其产品本身是“肽类制品”。“水解胶原蛋白”虽然与“胶原蛋白肽”为同一类产品，但水解是工艺过程，得到的产品则是肽，因此“胶原蛋白肽”的称谓则更能体现产品的本质。

同时也建议从事胶原蛋白产品研究与销售的行业协会及科研团体在以后的研讨、产品研发、质量检测等活动中，尽量区分“胶原蛋白”与“胶原蛋白肽”[7]，使产品的称谓符合其本身科学的定义。

2 胶原蛋白测定

目前，胶原蛋白并没有特异性的检测方法，国标中胶原蛋白总量的检测一般采用凯氏定氮法[8]，在实际生产或研究开发过程中还可以采用双缩脲法、紫外检测法、Lorry法等[9-12]，但无论采取哪种方法，所测定的值都代表了样品中总蛋白的含量或肽键的含量，而不只是胶原蛋白的含量。

虽然我国涉及胶原蛋白的几个标准中，目前大部分仍在使用凯氏定氮法对胶原蛋白进行检测[13]，但应该注意其凯氏定氮换算系数与一般蛋白质不同。

对几种不同来源胶原蛋白的氨基酸组分进行分析，确定其占总氨基酸中的数目，并计算N元素的含量，得到的凯氏定氮换算系数如表1。

表1 几种来源不同的胶原蛋白及肽类制品的氨基酸组分及N元素含量Table 1 Amino acid and N composition of collagen from various collagen byproducts

续表1 几种来源不同的胶原蛋白及肽类制品的氨基酸组分及N元素含量Continue table 1 Amino acid and N composition of collagen from various collagen byproducts

从来源不同的胶原蛋白及肽类制品氨基酸组分及N元素含量的分析表中可以看出[14-15]，由于胶原蛋白的特殊氨基酸组成导致其中甘氨酸的含量约占总氨基酸含量的三分之一左右，所以N元素的含量比一般的牛奶、鸡蛋蛋白的（16%）含量要高，如阿拉斯加鳕鱼胶原蛋白中N元素含量为18.7%，折算后凯氏定氮的系数只有5.35，牛皮胶原蛋白中N元素含量为17.54%，折算的凯氏定氮系数为5.70，因此国家标准中胶原蛋白及肽类制品中蛋白质检测项目中，凯氏定氮法折算常数是5.79，而不是一般的6.25。

由于羟基脯氨酸是胶原蛋白中特异性的氨基酸，在其他蛋白中不存在或很少存在，所以采用测定羟基脯氨酸含量的方法来比较产品中胶原蛋白的有效含量更为可靠。羟基脯氨酸含量的测定一般采用比色法，具体步骤可以参照GB/T 9695.23-2008《肉与肉制品羟脯氨酸含量测定》[16]。由于羟基脯氨酸含量测定过程中的影响因素[17]较多，在实验过程中应严格控制显色及测定的温度和时间。此方法测定过程中不需要昂贵的仪器和设备，方法适用性强。

就不同原料得到的胶原蛋白产品中羟脯氨酸含量而言，最低的是深海鱼胶原蛋白或肽类制品。即当产品中羟脯氨酸含量相同的情况下，深海鱼制品中胶原蛋白或肽类的有效含量最高，这也是当前大部分胶原蛋白声明其产品来源于深海鱼的原因之一[18]。由表1可以看出，对于牛皮或猪皮胶原蛋白来说，每1 000个氨基酸残基中，羟脯氨酸含量分别为94和91个，而对于大西洋鳕鱼和阿拉斯加鳕鱼来讲，分别为51和55个，折算成质量分数后，羟脯氨酸（hydroxyproline，HYP）的最高含量约11.57（牛皮），最低含量最低约为6.12%（大西洋鳕鱼）。在GB/T 22729－2008[19]《海洋鱼低聚肽粉》中，海洋鱼皮低聚肽粉中羟脯氨酸含量的限定≥3%，海洋鱼骨低聚肽粉中羟脯氨酸含量≥2%，标准相对偏低；而商业部中SB/T 10634－2011《淡水鱼胶原蛋白肽粉》中羟脯氨酸含量限定≥5.5%的标准，经过计算比较合适。为了保证测定样品中羟基脯氨酸来源于胶原蛋白或其肽类制品，还有必要测定样品中游离羟基脯氨酸占总羟基脯氨酸的比例，目前只有国家商务部发布的“淡水鱼胶原蛋白肽粉国内贸易行业标准 SB/T 10634－2011《淡水鱼胶原蛋白肽粉》[20]”中，对此项指标进行了明确的规定，即游离羟基脯氨酸与总羟脯氨酸的质量比≤5%。

另外由于胶原蛋白特殊的结构[21]，甘氨酸残基的量是所有氨基酸中含量最多的，约占总氨基酸残基数量的33%，折算成质量分数，其含量不小于总量的18%。但是目前我国的胶原蛋白及肽类制品标准中尚没有甘氨酸以及L-脯氨酸、丙氨酸的限定指标。在2010版国家药典中规定，阿胶中L-羟脯氨酸、甘氨酸、L-脯氨酸、丙氨酸这4种氨基酸的含量分别不得少于8.0%、18.0%、10.0%、7.0%。由于阿胶的原料是驴皮，其氨基酸组分相对稳定，所以检测标准较为容易确定。市售的胶原蛋白及肽类制品原料来源虽然复杂，但也可借鉴药典中对于阿胶氨基酸成分的规定，采用测定多种氨基酸含量的方法综合评定产品。

测定氨基酸的方法为高效液相色谱法或氨基酸自动分析仪法[22]，具体操作步骤参见GB/T 22729－2008《海洋鱼低聚肽粉》中6.3.2.2.1氨基酸自动分析仪测定方法和6.3.2.2.1高效液相色谱仪测定法测定氨基酸含量。

现今我国市售的胶原蛋白及肽类制品多为水产（淡水或海洋鱼类）胶原蛋白，少量来源于牛皮和牛骨。对于水产品，由于其具有富集水中重金属离子的作用，所以其胶原蛋白及肽类制品一般要检测重金属离子含量，如无机砷、甲基汞、铅、镉等，具体的检测过程参见金属离子相应的国家标准GB/T 5009.11-2014《食品安全国家标准食品中总砷及无机砷的测定》[23]，GB/T 5009.12-2017《食品安全国家标准食品中铅的测定》[24]，GB/T 5009.15-2014《食品安全国家标准食品中镉的测定》[25]和GB/T 5009.17-2014《食品安全国家标准食品中总汞及有机汞的测定》[26]，对于来源于牛皮和牛骨的胶原蛋白及肽类制品尚需要补充铬的指标，以防止制革后皮料的误入。

胶原蛋白及肽类制品的微生物检测及感官评价的方法本文不再论述，应符合我国食品或保健食品通用卫生要求。

表2 我国胶原蛋白肽理化指标标准汇总Table 2 Physicochemical Properties index from different criterions

3 产业标准制定

目前，我国现有的胶原蛋白标准及其适用范围的详细介绍如下：

QB 2732－2005《水解胶原蛋白》[27]：由国家发展改革委员会于2005年7月发布的轻工行业标准，适用于以明胶为原料生产的水解胶原蛋白粉和水解胶原蛋白水溶液，主要检测胶原蛋白产品的微生物指标和理化指标。此标准测定物质较全面，指标要求较高，但没有对羟脯氨酸含量的限定。由于目前胶原蛋白肽生产一般以动物的皮、骨等为原料，经热提取后加酶水解得到，而明胶是胶原蛋白肽制备过程中的一个中间产物，但并不是直接采用明胶作为初始原料提取胶原蛋白[28]，所以一定程度上导致了适用范围上的模糊，给使用带来了不便。

GB/T 22729－2008《海洋鱼低聚肽粉》国家标准：由国家质量监督检验检疫总局和国家标准化管理委员会于2008年12月发布的中华人民共和国国家标准，适用于以海洋鱼皮、鱼骨、鱼肉为原料，酶解法生产，分子量低于1 000 u的低聚肽（短肽）为主要成分的粉末状产品。产品按类别包括海洋鱼皮胶原低聚肽粉、海洋鱼骨胶原低聚肽粉、海洋鱼肉低聚肽粉3类。此标准测定的理化指标相对较少，要求比较宽泛，增加了分子量大小的限制，要求分子量范围要小于1000u。

经查文献，分子量一般不用u作单位，而是道尔顿（Da）[29]。而且对于目前胶原蛋白产品，其分子量范围不一定会低于1 000 Da，过分强调小分子量而降低了其他理化指标的要求，在检测中可能会出现主次颠倒的问题。

SB/T 10634－2011《淡水鱼胶原蛋白肽粉》：中华人民共和国商务部于2011年12月发布的国内贸易行业标准，适用于以淡水鱼皮和鱼鳞为原料，酶解法生产，分子量低于5 000 Da的胶原蛋白肽粉。此标准适用范围较窄（只限于淡水鱼），测定的理化指标较为全面[30]，其中首次引入游离羟脯氨酸占总羟脯氨酸的概念。与GB/T 22729－2008《海洋鱼低聚肽粉》国家标准相比，其分子量放宽到低于5 000 Da。但后面具体项目要求中包含分子量低于5 000 Da的胶原蛋白肽含量不小于85%、75%、65%等，则会带给人分子量不低于5 000 Da的另外15%、25%、35%的胶原蛋白肽部分到底适不适合本标准的疑问。

最后是较多的企业标准如Q/JYB 0065 S-2010《复配胶原蛋白粉》[31]：如由广州金叶保健品有限公司2010年6月发布的广东省食品安全企业标准，适用于以胶原蛋白粉，葡萄糖，植脂末为原料生产的复配胶原蛋白粉。此标准适用范围较广，测定物质较全面，但指标要求相对较低，同时缺少对羟脯氨酸含量的规定。

由以上分析可以看出，对于目前大量的以牛皮、猪皮、鸡皮等为原料生产的胶原蛋白肽尚没有统一的适用标准，即使对于大部分水产胶原蛋白肽，由于分子量限制，在使用上也有一定难度。

我国胶原蛋白肽理化指标标准汇总见表2。

各标准中，对于蛋白质含量均有具体的要求，标准2～4均标示采用干基含量，1号标准则没有说明。其中标准2中蛋白质含量以总氮占干基的百分比来表示，与其他标准不同。建议统一采用蛋白质质量占样品质量来表示。目前国内对于测定胶原蛋白中蛋白质含量使用的方法多为凯氏定氮法，换算系数为5.79。同时由表2可以看出，不同标准对于同一检测项目，要求的具体指标之间存在差异，而且对于水分、灰分差异较大，尚无较为统一的标准。

由于羟基脯氨酸是胶原蛋白及肽类产品标志性的氨基酸，所以羟基脯氨酸含量指标是标准中需要明确规定的。另外由于胶原蛋白特殊的结构，甘氨酸是所有氨基酸中含量最多的，约占总蛋白质33%，建议补充规定样品中甘氨酸的含量指标。

为了避免人为添加氨基酸，在标准中规定游离羟脯氨酸的含量也十分有必要，通过游离羟脯氨酸含量占总羟脯氨酸含量的数值，可以直观准确地检测出样品中是否存在人为添加羟脯氨酸的造假现象。

4 结论

本文在前人研究的基础上重点强调了胶原蛋白的称谓界定，明确“胶原蛋白”与“胶原蛋白肽”两种不同的概念。在制定胶原蛋白产品的国家标准上，文中对各类理化指标的制定给出了参考意见，同时建议通过几个指标综合评定来对胶原蛋白及其肽类制品进行定性及定量检测，即在常见的水分、灰分、粗蛋白的基础上增加羟基脯氨酸、甘氨酸、游离羟基脯氨酸含量、重金属离子含量等指标的检测，为制定更为科学规范的标准提供理论依据。

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