国内近10年铁皮石斛多糖研究进展

邹荣灿，王乾，孙俊，刘明月，向准，罗倩

（1.贵州师范大学生命科学学院，贵州贵阳550025；2.贵阳市长坡岭国有林场，贵州贵阳550014；3.贵州大学生命科学学院，贵州贵阳550025；4.贵州省生物研究所，贵州贵阳550009；5.贵州师范学院，贵州贵阳550018）

铁皮石斛（Dendrobium officinale）系兰科（Orchidaceae）石斛属（Dendrobium）多年生草本植物，主要分布于我国安徽、浙江、湖南、云南、广西等地[1]，是我国传统名贵中药[2]，具有益胃生津、滋阴清热、免疫调节、延缓衰老等功效；用于阴伤津亏，口干烦渴，食少干呕，病后虚热，目暗不明[3]。现代研究表明，铁皮石斛含多糖、生物碱、菲类、联苄类、氨基酸等多种活性成分[4]，其中多糖为其主要的活性成分，也是其中含量最高的物质[5]，具有降血糖[6]、降血脂[7]、降血压[8]、增强免疫力[9-12]、抗疲劳[13-14]、抗菌[15]、抗肿瘤[16]以及抗氧化[17-18]等作用，因其广泛的生物活性，备受科研工作者的关注，成为当今研究的热点，为今后对铁皮石斛多糖（Dendrobium officinale polysaccharides，DOP）的深度研究及相关药食品开发利用，该文从DOP的提取、含量测定、分离纯化、结构组成及生物活性等方面将近10年来的研究现状进行综述如下：

1 DOP的提取方法

经查阅国内外文献，目前用于DOP的提取方法主要有热水浸提法、超声波辅助提取法、微波辅助提取法、超高压萃取法、闪式提取法及酶提法，针对各提取方法分析其优势和弊端，为今后合理选择DOP的提取方法提供参考。

1.1 热水浸提法

热水浸提法操作简单、成本低廉，是提取DOP常选择的方法，原理是基于多糖易溶于水、不溶或微容于有机溶剂的性质，用高浓度乙醇（80%左右）将其从水中沉淀析出，再用适量无水乙醇或丙酮洗涤，经冷冻干燥后获得粗多糖。基本流程：样品→石油醚脱脂脱色→70%～80%乙醇除杂→蒸馏水浸提→醇沉过夜→离心→冷冻干燥→粗多糖。此法虽操作简单、条件温和、对仪器设备要求低，但提取率易受料液比、提取温度、提取时间等因素的影响。吴迪等[19]以水为溶剂，对影响DOP得率的提取时间、温度及料液比等因素进行了优化研究，结果表明，在料液比1∶120（g/mL）、浸提温度70℃、浸提时间90 min时DOP提取效果最好，提取率为55.2%。黄晓君等[20]同样对DOP的提取工艺进行优化，结果为料液比 1∶30（g/mL）、提取温度 90℃、提取时间2 h，在此条件下多糖得率为30.56%。而秦向东等[21]采用水提醇沉法、正交试验设计法优化DOP的提取工艺，优化后的最佳工艺为：温度95℃，提取时间2.5 h，pH 值 8，料液比 1 ∶40（g/mL），乙醇浓度 90%时，DOP提取率高达60.6%。

1.2 超声波辅助提取法

超声波辅助提取法是基于超声波的机械效应、热效应和空化效应作用，从而增大物质分子运动的频率和速度，提高溶剂穿击力，加快有效物质溶出，从而缩短提取时间。叶余原[22]探索DOP的超声波提取工艺条件，考察提取温度、固液比、提取时间和超声频率4个因素对DOP提取率的影响，结果表明：在1∶30（g/mL）的料液比，50℃超声水浴，45 kHz超声频率，提取1.5 h的条件下，DOP得率为15.3%，同等条件下较常规水提法（10.2%）得率高。此外，韩冉等[23]比较研究了超声辅助提取法和酶解法对DOP得率的影响，结果，超声辅助提取率为（15.78±0.072）%优于酶解法（14.89±0.053）%，超声波辅助提取法具有提取时间短、所需温度低、得率高的特点，但超声波功率不宜过高，否则会对多糖分子结构及特性产生负面影响。

1.3 微波辅助提取法

微波辅助提取法是基于微波穿透能力强的特点，利用物质在微波场中吸收微波能力的差异，使物质的某些区域或某些组分被选择性溶出，陈盛余等[24]分别考察了单因素料液比、微波功率、提取时间和提取温度对DOP得率的影响，结果表明，DOP的最佳提取工艺为料液比为1∶45（g/mL），微波功率900 W，提取时间30 min，提取温度95℃。在此条件下，DOP的提取率达9.77%。该提取工艺简单、快速，可以应用于从铁皮石斛中提取多糖物质，但也存在对溶剂要求严格、局限于实验室研究等弊端。

1.4 超高压萃取法

超高压萃取技术是近几年发展起来的较为先进的提取方法，在发达国家用于食品加工领域的研究已较为普遍，在国内主要用于灭菌、灭活、疫苗制取及中药有效成分提取等方面，将其作为植物多糖提取方法的文献鲜有报道，该法具有得率高、高效、快速、低能耗、绿色环保等优点。纵伟等[25]探讨了DOP的超高压提取工艺及条件优化，将石斛粉碎到80目后，按固液比 1 ∶20（g/mL），采用 300 MPa压力提取 6 min，DOP 的得率达19.27%。

1.5 闪式提取法

闪式提取法是一种用于植物软硬组织破碎的新型提取技术，依靠高速机械剪切力和超动分子渗滤技术，在室温及溶剂存在下数秒内把物料粉碎至细微颗粒，并使有效成分迅速达到组织内外平衡，通过过滤达到提取的目的，具有溶剂用量少、提取时间短、效率高等优点。蔡兴等[26]使用该法对铁皮石斛叶中多糖得率优化，结果表明：最佳提取工艺条件为以25倍量水提取3次，每次90 s，得率为11.52%。李娇等[27]比较了水提法、超声法和闪式提取法对DOP提取率的影响研究，并用正交试验法对最优方法进行条件优化，结果表明，水提法为10.90%，超声法为18.75%，闪式提取法为 24.05%，提取时间分别为 120、60、2 min；与传统水提法和超声法相比，闪式提取具有明显的优越性。

1.6 酶提法

酶提法是利用酶对植物细胞结构的破坏，使细胞内多糖有效的溶出。Hu等[28]利用Box-Behnken设计响应面法优化DOP的酶法提取工艺，结果最佳提取工艺条件为：酶用量3.5 mg/mL，水解温度53℃，反应时间70 min，DOP得率为16.11%，该法有效、稳定、可行。杨岩等[29]通过对酶解温度、酶解时间及加酶量3个因素进行优化，提高DOP提取率；结果显示，在酶解温度为40℃、酶解时间1 h、加酶量2.5%时，多糖提取率为38.4%，而不加酶处理仅为21.7%。尚喜雨[30]同样比较研究了酶法和水提法对DOP提取率的影响，结果酶法为26.49%，水提法为12.07%，酶法比水提法提高了119%。

基于以上不同提取方法，热水浸提法操作简单、成本低廉，但提取率低；超声波辅助提取法用时间短、所需温度低、得率高，但超声波功率不宜过高；微波辅助提取法工艺简单、快速，但局限于实验室研究；超高压萃取法得率高、高效、快速、低能耗、但对仪器设备要求高；闪式提取法和酶提法溶剂用量少、提取时间短、效率高；因原料的产地、处理方法不同，各提取方法提取的多糖得率有一定差异，因此，仅从多糖得率高低来判断提取方法的优越性没多大意义、可从多糖的纯度及活性方面综合考虑，建议研究者应根据自己研究的目的、要求、条件及环境选择适合的方法进行提取。

2 DOP含量测定及分离纯化

2.1 DOP含量测定

当前用于DOP含量测定的方法主要有苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法，其原理是利用强硫酸水解多糖成单糖，形成糠醛化合物与苯酚或蒽酮形成有色物质，再利用其在可见光区的最大吸收波长作为检测波长进行含量测定。苯酚-硫酸法检测波长（490 nm左右），蒽酮-硫酸法检测波长（620 nm左右），有研究表明，同一样品，采用蒽酮-硫酸法测定多糖的含量高于苯酚-硫酸法，但苯酚-硫酸法的测定结果较为合理，可作为DOP含量测定的首选方法[31]。苯酚-硫酸法测多糖仅在一定时间内稳定性良好，因此，在显色过程中要严格控制好时间、显色剂及硫酸的用量问题，避免外界因素带来的误差。另外DNS比色法（3，5-二硝基水杨酸比色法）、高效液相色谱法也可作为DOP含量的测定方法。为保证测量值更加准确，在测量前需排除去色素，蛋白、单糖、寡糖等干扰。

2.2 DOP分离纯化

经不同方法提取的DOP中常含有蛋白质、色素、单糖、寡糖、脂类等杂质，如何除去这些杂质至关重要，如不除去杂质将影响提取物中多糖的含量及纯度，影响其活性和功效，甚至影响结构鉴定及构效关系的研究。目前，国内外除去DOP中蛋白常用的方法有Sevag法、三氯乙酸法、酶法、酶-Sevag法、等电点法、盐酸法等[32]，其中Sevag法的优点是适用范围广、成本低、检测速率快、脱蛋白率高等，缺点是易损失提取物中的多糖影响其活性，另外Sevag法主要是除去游离蛋白，而很难除去与多糖结合的蛋白。三氯乙酸法脱蛋白较完全，但易使多糖降解，且残留的三氯乙酸还会带来安全隐患；DOP脱色的方法有活性炭脱色法、H2O2氧化法、离子交换树脂法等。较常用的是活性炭脱色，因为活性炭为黑色多孔性粉末或颗粒，无嗅无味，具有较大的表面积，吸附能力强，脱色成本低等特点，李国涛等[33]探讨DOP活性炭脱色工艺，以脱色率和多糖保留率为指标，结果表明：活性炭吸附法对DOP具有良好的脱色效果，最佳工艺条件为：温度为70℃，活性炭使用量为体积分数0.5%，搅拌60 min，脱色率为71.64%，多糖保留率为87.29%；严婧等[34]以总多糖保存率和蛋白脱除率为评价指标，通过单因素试验比较Sevage法、木瓜蛋白酶法、胰蛋白酶法和胰蛋白酶联合Sevage法，结果表明：胰蛋白酶联合Sevage法具有较高的总多糖保存率及蛋白脱除率，最佳工艺条件为酶解时间1.5 h，酶用量0.21 g/mL，酶解温度63.25℃，总多糖溶液-Sevage试剂体积比（4.27∶1），蛋白脱除率（87.15±7.93）%，总多糖保存率（81.32±8.54）%。

2.3 DOP结构组成

要进一步探究DOP的组成、分子质量、结构特征，在脱色脱蛋白的基础上还需进一步分离纯化，常用的分离纯化方法有离子交换树脂法、凝胶过滤柱色谱法、亲和色谱法、膜分离法。分析DOP成分是研究其生物活性的重要前提，王琳炜等[35]采用传统的水提醇沉法提取霍山DOP，经酶-Sevag法脱蛋白，再经DEAE-52纤维素柱、SephadexG-100凝胶柱分离纯化得到石斛多糖组分DOPA-1，单糖组成为甘露糖、葡萄糖和半乳糖，其物质的量比为1∶0.42∶0.27。龚庆芳等[36]发现构成DOP的单糖不仅包括甘露糖、葡萄糖和半乳糖，还包括阿拉伯糖，其摩尔比为3.28∶31.83∶1.51∶1.00。罗秋莲等[37]利用DEAE-52纤维素柱及Sephadex G-100对铁皮石斛粗多糖进一步纯化得4个组分，其中DOP1由甘露糖、葡萄糖醛酸和葡萄糖组成摩尔比为3.42 ∶0.11 ∶1.08；DOP2、DOP3、DOP4 均由甘露糖和葡萄糖组成摩尔比分别为 8.56 ∶1.12；4.91 ∶1.0；3.61 ∶1.01。而宾宇波等[38]研究发现 DOP 由 D-甘露糖、L（+）-鼠李糖和D-葡萄糖组成，其摩尔比为1.936∶0.856∶0.691。Luo等[39]研究发现DOP由甘露糖、葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖组成，摩尔比为6.2∶2.3∶2.1∶0.1。各文献报道的DOP组成及摩尔比存有一定差异，可能原因是因原料的产地、加工及纯化等方式的不同所致（见表1）。

3 DOP的生物活性

铁皮石斛被誉为“救命仙草”和药界的“大熊猫”，斛中的极品，现代研究表明DOP为其主要的功效成分之一，在降血糖、降血脂、增强免疫力、抗氧化、抗疲劳、抗菌及抗癌等方面具有显著疗效，另外DOP还具有促毛发生长、改善肺功能和炎症、增强胃肠道转运率等作用（见表2），对于研发更多DOP的药物制剂和保健产品，具有重要的经济价值和市场前景。

表1 DOP的提取、分离纯化及单糖组成Table 1 The extraction，isolation and monosaccharide composition of Dendrobium officinale polysaccharides

表2 铁皮石斛多糖的生物活性Table 2 The biological activities of polysaccharide from Dendrobium officinale

4 展望

综上所述，DOP的提取方法有热水浸提法、超声波辅助提取法、微波辅助提取法、闪式提取法、超高压萃取法及酶提法；含量测定方法有苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法、3，5-二硝基水杨酸比色法、高效液相色谱法；分离纯化方法有离子交换树脂法、凝胶过滤柱色谱法、亲和色谱法、膜分离法。DOP在降血糖、降血脂、增强免疫力、抗氧化、抗疲劳、抗菌及抗癌等方面具有显著疗效，另外还具有促进毛发生长、改善肺功能和炎症、增强胃肠道转运率等作用。

随着科研工作者对DOP的日益深入研究，在DOP的提取、含量测定、分离纯化、结构组成及生物活性等方面做了大量的研究工作，已取得了一定的成效。但仍存在一些问题亟须解决：①DOP的最适提取方法目前尚无定论，目前应用较多的提取方法是热水浸提法，随着科学技术的不断进步，超声波辅助提取法、微波辅助提取法、超高压萃取法、闪式提取法及酶提法等也相继应用于DOP的提取，这些方法的应用大大缩短了提取时间，更易获得目标产物，还有一些较为先进的方法尚未用于DOP的提取，如超临界流体萃取、双水相萃取等，这些方法能否提高DOP的得率还有待进一步研究。因DOP的提取方法较多，各方法均有利弊，建议研究者跟据研究的目的、要求和条件对其合理选择。②结构决定性质，对DOP的结构研究还处在一级结构中单糖的组成及分子量大小等阶段，对于高级结构的研究进一步揭示DOP构效关系、代谢机理及作用机制是目前仍需迫切解决的问题。③DOP的药理活性已被大量实验证实，但都局限于粗提物，如何开发符合临床需求的药物制剂和相关保健品的开发，有待进一步研究。

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