我国羊肚菌人工栽培快速发展的关键技术解析

刘 伟 蔡英丽 张 亚 边银丙*



我国羊肚菌人工栽培快速发展的关键技术解析

刘 伟1蔡英丽1张 亚2边银丙1*

（1. 华中农业大学应用真菌研究所，湖北 武汉 430071；2. 四川省菌益侬农业科技有限公司，四川 成都 610000）

论述菌种技术和外源营养袋补料技术是促进我国羊肚菌人工栽培快速发展的两项关键性技术。着重解析羊肚菌菌种的分类、驯化、可栽培品种的选择和优良品种的选育方向，介绍外源营养袋补料技术的由来、理论、革新，以及改进、提高的研究方向。

梯棱羊肚菌；驯化栽培；补料技术；外源营养袋；菌种选育；多孢杂交

羊肚菌（spp.）是一种世界性分布的名贵珍稀食用菌，因其质地柔嫩，风味独特，并具有抗氧化、抗炎、抗菌、免疫调节和抗肿瘤等多种生理活性，吸引了全世界不少科技工作者进行驯化研究[1,2]。羊肚菌的驯化栽培研究历程坎坷，前后经历上百年，直到20世纪80年代，才有美国的科学家Ower先生成功实现了羊肚菌的室内栽培[2,3]，然而该技术并未有效推广和商业化应用。我国的羊肚菌人工栽培同样开始于20世纪80年代，先后有一大批科技工作者及爱好者参与其中，历时多年未有明显的起色[2, 4～7]。直至21世纪初，原四川省林业科学院副研究员谭方河在驯化栽培研究中意识到特定品种有容易出菇的特性，进而筛选到易出菇品种，为后续的驯化栽培研究奠定了基础。外源营养袋补料技术的原理在Ower的栽培专利中早有论述，但长期以来未被后人理解应用；谭方河偶然利用外源性营养物的补料作用，实现了羊肚菌产量的稳步提升，进而逐步改善，演化为现今的外源营养袋补料技术[7～10]。

易出菇羊肚菌品种的获得和外源营养袋补料技术的研发是羊肚菌人工栽培稳健发展的重要保障。这两项重要技术促进了我国羊肚菌人工栽培的快速发展。本文对羊肚菌菌种的品种分类，曾被用于驯化研究的羊肚菌品种，当前大规模栽培应用的羊肚菌品种，羊肚菌的品种特殊性，以及外源营养袋补料技术的原理、由来、发展和演化进行梳理，进而论述羊肚菌优良品种的选育和外源营养袋补料技术的发展方向。

1 菌种技术

1.1 羊肚菌的品种分类

羊肚菌在分类地位上隶属于子囊菌门（Ascomycota）、盘菌纲（Discomycetes）、盘菌目（Pezizales）、羊肚菌科（Morchellaceae）、羊肚菌属（）[2]。羊肚菌具有明显的形态可塑性，环境条件如温度、湿度、光照等的微小波动，均可对羊肚菌不同发育阶段的形态产生影响，使其呈现高度的形态多样性，并因此在一定程度上造成早期羊肚菌品种分类上的混乱。近年来，随着分子生物学，特别是多基因系统发育学建立，才系统地确立了羊肚菌的种间分类地位。国内外多个团队基于该项技术对全球的羊肚菌进行了系统研究，迄今确立的羊肚菌系统发育学种有69个，隶属于三大分支：黑色羊肚菌类群（Elata Clade）、黄色羊肚菌类群（Esculenta Clade）和变红羊肚菌类群（Rufubrunnea Clade）[2, 11]。杜习慧等对我国不同地区的羊肚菌标本结合全球的羊肚菌标本进行了详尽的系统发育分析，指出中国的羊肚菌从属于30个不同的系统发育学物种，其中黑色羊肚菌类群的种有13个，黄色羊肚菌类群的种有17个[12, 13]。

1.2 曾被用于驯化研究的羊肚菌品种

截至目前，被成功驯化的羊肚菌品种有9个，其中黑色系的有：尖顶羊肚菌（）[4,5, 14～18]、黑脉羊肚菌（）[19]、梯棱羊肚菌（）、六妹羊肚菌（）和七妹羊肚菌（）[2, 24]；黄色系的有粗柄羊肚菌（）[20]、羊肚菌（）和小羊肚菌（）[21]；变红羊肚菌（）是一个分布于欧洲和美洲的品种，国外的成功驯化报道主要基于该种进行[8～10，22]。

国内的早期驯化研究主要基于尖顶羊肚菌、黑脉羊肚菌、粗柄羊肚菌、羊肚菌和小羊肚菌进行，其中尖顶羊肚菌的驯化研究报告最多。由于该部分文献资料中使用的品种未有准确的分类特征描述和菌株备份，基于现有的资料无法对这些品种的准确系统发育学地位进行对应，且该类研究均未有明显的商业化推广应用，而不同的羊肚菌品种具有明显的不同生活习性和营养方式，建议现今的生产者在当前的栽培模式下，要慎重选择菌种，尽量不要选用未经系统研究的品种。

1.3 当前大规模栽培应用的羊肚菌品种

王波和鲜灵2013年对四川省大邑县、崇州市、郫县和涪城区的羊肚菌人工栽培品种进行鉴定后指出，4个地区栽培的羊肚菌品种均为梯棱羊肚菌[23]。我们自2012年起，在川、渝各地进行羊肚菌驯化栽培和标本采集整理工作，对收集的4个商业推广菌株羊肚菌1号（商业团队自由命名，下同）、羊肚菌3号、羊肚菌6号和羊肚菌7号菌株作了详细的形态特征记录和ITS序列分子鉴定分析。结果表明，羊肚菌1号和3号是梯棱羊肚菌，羊肚菌6号为六妹羊肚菌，羊肚菌7号为七妹羊肚菌[24]。随后，我们对收集到的云南、贵州、湖北和河南，以及羊肚菌主产区川、渝一带商业应用的菌株共26个利用DNA分子序列进行了系统发育学分析，结果和前期的数据相吻合：目前规模化栽培的品种主要为梯棱羊肚菌、六妹羊肚菌。这两个品种的栽培面积占整个产业的80%～90%，伴有少量的七妹羊肚菌[2, 24]（图1）。

注：左图为梯棱羊肚菌4号，典型特征为胖锥形，菌盖色棕黄色，菌柄较短小；右图为六妹羊肚菌13号，典型特征为脊厚实，菌盖整体呈尖锥形，棕黑色。

1.4 羊肚菌品种的特殊性

羊肚菌具有明显的快速老化和退化特征。老化是生物的自然属性，涉及凋亡、自噬、坏死等多种基础生物学现象。高羊肚菌的不同菌株在CYM培养基上连续继代培养1 400～2 250小时后表现出不可逆转的老化死亡现象[25]。这种现象同样存在于粗柄羊肚菌、梯棱羊肚菌和六妹羊肚菌中。老化的菌丝细弱，生长速度下降，菌核产生能力丧失，最后彻底停止生长，菌丝尖端破裂而死亡[2]。菌种的老化与实际生产中菌种的无休止扩繁、保藏不当等密切相关，老化的菌种不能用于生产。

生物体在进化过程中优良性状丧失称之退化。羊肚菌的品种退化现象明显，退化菌株在生产中主要表现为出菇不整齐，出菇少甚至不出菇，畸形菇较明显等。如2013年之前大规模应用的梯棱羊肚菌3号菌株（2013年后逐渐被淘汰出市场），以及近年来应用较多的梯棱羊肚菌1号菌株，均表现出明显的退化现象。近年来多个基地出现因使用退化菌株而造成严重减产和发生畸形菇等事件，值得我们关注[2]。

不同品种的适应性和商品性状不同，如六妹羊肚菌6号菌株，在抗高低温方面具有明显优势，但其肉质较松软，易碎，不宜用作鲜品销售。梯棱羊肚菌4号菌株抗性稍差，但菇体呈宽圆锥形，肉质较厚，菌柄较短小，无论是鲜品还是干品均具有较强的市场优势。

2 外源营养袋补料技术

2.1 历史由来及原理

Ower在其1986年的羊肚菌栽培专利中首次提及并论述“外源性营养物”的“营养补充”问题[8]，Ower对其原理和适用方法的解释是：由于羊肚菌需要在一个营养相对贫乏的环境中才能进行有性生殖，而其菌丝自身储备的能量又不足以支撑其有性生殖，因此需要从外界吸收新的营养物质，只有适时供给营养物质才能确保新形成的菌丝储备足够的营养物质；在营养供给方式上，需要保证在生产后期营养物便于移除以使菌丝仍旧处在营养贫乏的环境中，以利于转化为有性生殖。进而，Ower在专利中提供了一种便捷的处理方法，用培养菌核的层级菌种制作工艺进行“外源性营养物”的补充。具体做法是使用广口罐头瓶或其他相似容器，装入以麦粒和有机质为主的培养料，灭菌后倒扣在土壤表面的菌丝上，使菌丝可以长入并同化吸收瓶内的营养成分，再将转化吸收的营养成分通过菌丝输送到土壤基质层中储存起来。如此培养7～40天之后，移除外源性营养源，刺激出菇[8]。后来，Ower在1988年和1989年的专利中提供了另一种更接近现代的外源营养袋的营养补充方案，即采用塑料袋装入含水量为30%～50%的纸屑和碎布，在袋的一边打孔后扣在土壤表面的菌丝上，确保菌丝可以通过小孔钻入袋内，通常情况下5～7天菌丝可长满塑料袋。之后每隔2～3天按照一定剂量，对塑料袋内的纸屑和碎布补充一次0.5%～1.0%浓度的尿素水溶液。两周后移除塑料袋，刺激出菇[9, 10]。

Ower在专利中并未强调或比较外源性营养物质补充技术在栽培中的决定性作用，且多次指出直接用培养的菌核或液体发酵培养的营养菌丝体进行水化处理后播种，紧随其后直接控制水分催菇，可以成功实现出菇。Ower还指出，相对于外部营养物的补充栽培法，后一种栽培方式的明显优势是可以允许土壤基质深度较深，可以达到6～16厘米，播种量可以增大到每平方米1.5～4.0千克，厚的培养基质和播种量可以提供足够的营养物质供子囊果发育，并指出后一种栽培方式可以明显缩短生产周期[8～10]。这可能导致Ower的外源性营养物质的补充理论在较长时期内被忽视，1986年Ower先生不幸辞世也影响了外源性营养物的跟进研究。

2.2 外源营养袋补料技术的革新

我国最早探索和使用外源营养袋的是原四川省林业科学研究院副研究员谭方河。早在2000年前后，谭方河曾认为“不同菌丝的配合” （不同极性的菌丝杂交）可能有助于出菇，因此开发了一种新的“杂交”处理方法：首先用一种类型的菌丝制作菌种，在土壤内播种，待菌丝萌发封面后，再在菌床上扣上接种有另一种类型菌种的营养包（袋），实现两种菌丝的融合，诱发出菇。结果显示此方法具有一定的增产效果，从而猜想羊肚菌有性繁殖确实需要两种类型的菌丝融合，早期曾称该技术为“菌丝融合技术”。后来在对“菌丝融合技术”进行进一步验证时却发现一个悖论现象：不采用倒扣菌丝体营养包，而直接将两种类型的菌丝体混合在一起播种，从理论上讲出菇概率应该更大，可事实恰恰相反，这样混合播种几乎不出菇，这就推翻了“菌丝融合技术”促进出菇的猜想。至2005年前后，谭方河根据Ower关于外源营养物的技术原理，只用一种类型的菌丝播种，菌丝长满播种面后再在上面倒扣经灭菌冷却而不接种的营养包（袋），出菇好且稳定，而不放营养包（袋）的对照则几乎不出菇，进一步验证了营养包（袋）在羊肚菌人工栽培探索中的重要价值。由此，真正掌握了羊肚菌人工栽培中的外源营养袋营养供给理论，经过多年实践最终发展成为今天的外源营养袋补料技术[2, 7]。

除Ower外，国际上未见其他近似于羊肚菌外源性营养补充的研究报道。国内的陈万鹏等[26]、陈文和吴广顺[27]、赵琪等[28]、石代勇[29]、罗兴富等[30]、秦小波等[31]、姜邻等[32]、罗金洲等[33]、兰顺明等[34]、罗倩茹[35]近年来先后公开申请了一大批有关或近似于外源营养袋技术的专利报道。此系列专利中少有关于外源性营养物补充的理论论述。在作用时间上具有明显的不同：陈万鹏等为“播种后35～55天，在厢面上施入一种羊肚菌生长促进剂，使用量为每亩1 400～1 800袋”[26]；秦小波等是“菌丝长到地面时进行下袋”[31]；姜邻等为“在羊肚菌菌丝形成后20～25天施放转化袋”[32]；罗倩茹的“灭菌冷却后放在土壤面上的菌丝上，一般6天后可陆续出菇”[35]。

不同专利的“营养袋”的配方也有明显不同：Ower的外源性营养物主要是“40%～80%有机质、20%～60%土壤”或“含水量30%～40%的碎纸屑，0.5%～1.0%的尿素水溶液”[8]；陈万鹏等的是“干麸皮15%、干小麦85%”[26]；石代勇的是“杂树木花28%、小麦67%、石灰5%”[29]；罗兴富等的是“杂树木花28%、小麦41%、玉米粉26.5%、石灰4.5%”[30]；秦小波等的是“30～35份谷壳，30份小麦，25～33份木屑，4～5份土，1～1.5份土豆粉，0.5～1份石膏，0.5～1份石灰，0.5～1份草木灰，0.3～0.6份丁酸钠，0.2～0.5份氯化钠，0.4～0.6份硫酸镁”[31]；姜邻等的是“纯小麦，加1%的石膏”[32]；兰顺明等的是“小麦70%，谷壳28%，石灰1%，石膏0.95%，硫酸锌0.025%，无水硫酸镁0.025%”[34]；罗倩茹的是“杂树木花27.5%，小麦41%，玉米粉27%，石灰4.5%”[35]。

外源营养袋的形式和使用方法在生产中逐步朝着便捷性、有效性层面发展。如早期使用“立袋”[7]，与Ower专利中的广口瓶倒扣在菌床上类似，将灭好菌的营养袋开口后立扣在菌床上；随后逐渐过渡到“平摆袋”，即袋子侧面划口或打孔后，孔口朝下贴扣在菌床上（图2）。平摆袋相比立袋在操作上明显便利，同时能明显缩短菌丝满袋时间，有效地转化吸收袋内的营养；袋子的大小和使用量也在被优化，经验表明，每个外源营养袋的作用面积为以袋子为中心的直径50～60厘米范围，因此，袋与袋的平均间隔为40～50厘米，即每亩（667平方米）的外源营养袋使用量为1 600～1 800袋。

注：外源营养袋在菌丝封面之后，均匀地摆放在畦面上，每个外源营养袋为一定范围内的菌丝网络提供营养。

早期称整套技术为“菌丝融合技术” “二次补种或二次接种技术”，随后过渡到“营养包” “营养袋” “转化袋”等。“外源营养袋”的“外源”对应Ower所论述的“exogenous nutrients”外源性营养的意思，是外部营养供给[8]。结合其作用原理和形态特征，称之为“外源营养袋”最为贴切合理，是现阶段广为流行的称谓。

3 展 望

3.1 优良菌株的选育

当前我国大规模商用的羊肚菌品种均来自自然选育，规范的自然选育流程和合理的保藏措施是确保羊肚菌优良品种长期留存的关键。然而，自然选育的随机性较大，选育周期也较长，有必要借鉴常规食用菌的育种技术选育新的优良的羊肚菌品种。

原生质体育种和诱变育种是两种优势明显的育种技术，国内外有关羊肚菌原生质体技术的研究大多停留在制备和再生环节。刘士旺等将制得的尖顶羊肚菌原生质体悬液置于离紫外灯（30瓦）30厘米处照射60秒进行诱变处理，然后进行再生培养，得到生物量比出发株提高7.3%、总氨基酸含量比出发株提高38%的突变株[36]。除此之外，未见其他关于羊肚菌遗传育种的研究。

梯棱羊肚菌的交配型已初步得到研究，单孢菌株为同核体。然而，羊肚菌的倍性和出菇理论还未有明确的结论[2]。在遗传背景缺乏的情况下，借助于多孢杂交选育新品种不失为一种有效的手段[2]。

3.2 外源营养袋补料技术的发展方向

外源性营养补充理论和羊肚菌菌核形成理论基本类似，营养物质倾向于在营养贫瘠环境下储存在菌丝细胞或菌核状细胞内[2,37,38]。外源营养袋正是充当了这样一种高营养势能的培养基质，土壤内的菌丝网络为低营养势能的环境，营养袋内的营养物质通过菌丝的同化吸收最终转移到土壤内部的菌丝网络中被储存，随后供给有性生殖所需。有关外源性营养物质的作用机理、转化效率和形式仍需作进一步的探索。

各种基料均适宜于羊肚菌的代谢利用，如小麦、玉米芯、麸皮、秸秆、木屑、腐殖质落叶、农作物废弃料等。当前大规模应用的外源营养袋规格为12×24（厘米），每亩地用1 600～1 800袋。每袋的基质含量：主料为80～120克小麦，额外添加40克谷壳，或40克木屑和20克谷壳，或40克玉米芯和20克谷壳，腐殖质土20～40克，最后添加1%～1.5%生石灰，2%石膏和1.5‰磷酸二氢钾。按照常规食用菌菌种拌料和灭菌流程进行制作使用。至目前未见任何关于外源营养袋的配方优化和使用数量优化的研究报道。

根据外源性营养物质补充对羊肚菌的生产具有重要作用及外源营养袋作用机理，可尝试在外源营养袋的使用效率、操作便捷性方面加以改进。如生产前期的大袋（15厘米×45厘米、22厘米×45厘米袋子）改变为现如今的12×24（厘米）小袋，以及改立袋为平摆袋等，均是在外源性营养物的转化效率、便捷度上的成功尝试。

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刘伟（1984—），研究方向为食用菌遗传育种。Tel/微信：18071090012；E-mail：zhenpingliuwei@163.com。

，E-mail：bianyb.123@163.com。

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