无添加酿造酱油的低聚肽特征性分析

陈建国,梁寒峭*,王憬,刘伟,程池,荣长远

1(中国食品发酵工业研究院，中国工业微生物菌种保藏管理中心，北京， 100015) 2(聊城正信生态农业科技园有限公司，山东 聊城，252000)

酱油含有丰富的风味物质、矿物质、维生素等营养成分，以及生理活性物质，如大豆多肽、大豆异黄酮、大豆皂苷、有机酸等，具有促进消化、增强食欲、消炎、降血压、抗氧化等多种功能[1-3]。酿造酱油是指以大豆或脱脂大豆、小麦和(或)麸皮为原料，经微生物发酵制成的具有特殊色、香、味的液体调味品[4]。无添加酿造酱油是指大豆、小麦等原料经微生物发酵结束后，不再使用任何食品配料、食品添加剂，制备而成的酿造酱油。无添加酿造酱油(无添加酱油)配料表中只标注含有大豆或脱脂大豆、小麦和(或)麸皮、食盐等原料，不含有白砂糖、酵母提取物等食品配料，以及甜味剂(三氯蔗糖、安赛蜜等)、增鲜剂(谷氨酸钠、5′-肌苷酸二钠、5′-鸟苷酸二钠等)、防腐剂(苯甲酸钠、山梨酸钾等)、焦糖色素等。

酱油低聚肽主要为大豆低聚肽，指在酱油生产过程中，大豆蛋白质经酶解产生游离氨基酸的同时，还保留了大量中间产物——小肽分子。大豆低聚肽不仅具有良好的水解性、稳定性和易吸收等特点，而且具有调节肠道、增强免疫力、降血脂、降血压、抗疲劳等功能[6-10]。目前关于酱油中的游离氨基酸、氨基酸态氮、有机酸、风味物质等研究较多[11-13]，但对酱油中低聚肽特征性的研究鲜见报道。本研究首次分析了酿造酱油低聚肽含量、分子质量分布及其氨基酸组成，为科学评价酿造酱油的营养及品质提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料及试剂

1号酱油样品(无添加酿造酱油，特级酱油)，聊城正信生态农业科技园有限公司提供；2号酱油样品(酿造酱油，特级酱油)和3号酱油样品(酿造酱油，三级酱油)，均购于北京家乐福超市；其他化学试剂均为分析纯。

表1 酱油产品信息Table 1 Information on soy sauce products

1.2 仪器

LC-20A高效液相色谱仪，日本岛津公司；A300型氨基酸分析仪，德国 Membrapure公司；3K-15型冷冻离心机，德国Sigma公司。

1.3 实验方法

1.3.1 低聚肽含量测定[14-15]

酱油样品经三氯乙酸溶液溶解后，离心分离出沉淀蛋白质，收集离心清液。分别测定离心清液的酸溶蛋白质水解物含量和游离氨基酸含量，按照公式(1)计算酱油低聚肽含量：

m=m1-m2

(1)

式中：m，低聚肽含量,g/l00mL；m1，酸溶蛋白质水解物含量,g/l00mL；m2，游离氨基酸含量,g/l00mL。

1.3.2 低聚肽相对分子质量分布分析[16-17]

采用高效液相色谱法对小麦低聚肽相对分子质量进行分析，色谱条件如下:色谱柱：TSK gel G2000 SWXL 300 mm×7.8 mm；流动相：V(乙腈)∶V(水)∶V(三氟乙酸)=45∶55∶0.1；检测波长：UV 220 nm；体积流量 0.5 mL/min，柱温 30 ℃，进样体积 10 μL。4 种不同相对分子质量的肽标准品为：细胞色素C(MW12 500)，杆菌酶(MW1 450)，乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(MW451)，乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(MW189)。

1.3.3 低聚肽的氨基酸组成分析[18]

将方法1.3.1得到的酸溶蛋白质充分水解后，采用氨基酸自动分析仪测定其氨基酸组成，按照公式(2)计算低聚肽的氨基酸组成含量：

Xk=Xk(1)-X(k2)

(2)

式中：Xk，低聚肽中k型氨基酸含量,g/l00mL；Xk(1)，酸溶蛋白质水解物中k型氨基酸含量,g/l00mL；Xk(2)，游离氨基酸中k型氨基酸含量,g/l00mL；k，某一种氨基酸类型。

1.4 数据分析

采用SPSS v19.0软件进行统计分析，数据结果以“平均值±标准差”(n=3)表示，Duncan法进行显著性分析，p<0.05表示数据间存在显著性差异。

2 结果与分析

2.1 低聚肽含量测定

依据酿造酱油GB 18186—2000对3个样品进行了基本指标的检测，如表2所示。样品1和2中氨基酸态氮均大于0.8 g/100mL，无盐固形物含量均大于15 g/100mL，且全氮含量均大于1.50 g/100mL，表明样品1和2属于特级酱油，而样品3酱油中氨基酸态氮、无盐固形物和全氮含量均符合三级酱油标准。

样品2中酸溶蛋白质水解物和游离氨基酸含量分别为12.10 g/100mL和9.06 g/100mL，均显著高于样品1和3。且样品2由于外源添加了谷氨酸钠的缘故，其谷氨酸含量高达5.42 g/100mL，分别是样品1和3的12.04倍和20.85倍，占酸溶蛋白质水解物和游离氨基酸的比例分别高达44.79%和59.82%。酱油低聚肽测定结果如表2所示，无添加酱油样品1的低聚肽含量最高，为6.79g/100mL，显著高于样品2(3.04 g/100mL)和样品3(2.95 g/100mL)，分别是样品2和3的2.23倍和2.30倍。

表2 酱油相关指标的测定 单位：g/100mL

注：小写字母不同表示数据间差异显著(p<0.05)。

2.2 低聚肽相对分子质量分布

肽标准品的凝胶过滤色谱图如图1所示，lgMW为纵坐标，保留时间t为横坐标，肽分子量的标准曲线为lgMW=-0.200t+6.689，R2=0.996 6。

1-细胞色素C(MW 12 500);2-杆菌酶(MW 1 450); 3-乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(MW 451);4-乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(MW 189)图1 不同相对分子质量的肽标准品色谱图Fig.1 Chromatogram of peptides with different relative molecular mass

酱油低聚肽分子质量分布如表3所示，样品1、2和3酱油低聚肽分子质量大多在1 000 Da以下，占比分别为95.26%、97.14%和89.07%，3者之间无明显差异。以氨基酸平均分子质量为137计算，推测酱油低聚肽主要由六肽以下的小分子肽段构成。研究表明，小肽分子更容易快速通过小肠薄膜被人体吸收利用，进而发挥其保健功能[19-20]。样品1、样品2和样品3酱油中分子质量140～500 Da的活性低聚肽占比分别为47.47%、35.82%和36.04%，多为易被人体吸收的二肽和三肽，研究表明小分子的肽段具有较高的抗氧化活性[21]。样品1、样品2和样品3酱油活性低聚肽含量分别为3.22、1.09和1.06 g/100mL，样品1酱油活性低聚肽含量分别是样品2、样品3的2.95和3.03倍。

表3 酱油低聚肽分子质量分布 单位：%

2.3 低聚肽氨基酸组成分析

酱油低聚肽的氨基酸组成分析结果(图2)可知，酱油低聚肽氨基酸组成种类丰富。对3款酱油低聚肽的氨基酸质量浓度进行了比较分析，样品1中排名前4位的水解氨基酸为谷氨酸、天冬氨酸、脯氨酸和甘氨酸，样品2中排名前4位为谷氨酸、丝氨酸、天冬氨酸和脯氨酸，样品3中排名前4位为谷氨酸、天冬氨酸、缬氨酸和脯氨酸。3种酱油水解氨基酸含量差异较大，其中谷氨酸和天冬氨酸占比例较多，这与原料中组成蛋白质的氨基酸比例有很大关系，其中大豆蛋白质中谷氨酸和天冬氨酸含量较多，而蛋氨酸、半胱氨酸、色氨酸含量很少[22]。

图2 酱油低聚肽的氨基酸组成Fig.2 Amino acid composition of oligopeptides in soy sauce

酱油低聚肽氨基酸组成中富含人体所需的8种必需氨基酸，如表4所示，样品1酱油多肽必需氨基酸总量为1.229 g/100mL，占总氨基酸的32.45%，而样品2和样品3酱油多肽必需氨基酸总量仅分别为0.589 g/100mL和0.468 g/100mL。样品1酱油多肽必需氨基酸总量分别是样品2和样品3的2.08和2.63倍。赖氨酸为碱性必需氨基酸，是人体的第一必需氨基酸，具有增强免疫力、促进人体生长发育、提高中枢神经组织功能等作用[23-24]。但由于谷物食品中的赖氨酸含量较低，且在食品加工过程中易被破坏而缺乏，故称为第一限制性氨基酸。样品1酱油多肽中赖氨酸含量为0.153 g/100mL，是样品2和样品3的4.37和30.60倍。

表4 酱油低聚肽必须氨基酸的组成 单位：g/100mL

3 结论

本文首次测定了无添加酱油中低聚肽含量、分子质量分布及其氨基酸组成，并与特级和三级普通酿造酱油样品进行了比较分析。结果显示无添加酱油低聚肽含量为6.79 g/100 mL，其中活性低聚肽(分子质量140～500)组分高达47.47%，显著高于特级和三级普通酿造酱油样品。无添加酱油多肽必需氨基酸总量分别是特级和三级酱油样品的2.08和2.63倍，其中赖氨酸在3款酱油低聚肽中的含量差异极显著，赖氨酸可作为一种特征性氨基酸来区分无添加酱油与普通酿造酱油。因此，无添加酱油中低聚肽含量更高，尤其是活性低聚肽，且人体必需氨基酸含量更丰富。

综上，本研究在酱油常规检测指标(氨基酸态氮、全氮、可溶性无盐固形物等)基础上，提出了更加深入的酱油品质评价指标——低聚肽，为科学评价酿造酱油的营养及品质提供新的研究思路。

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