转录因子2过表达改善人肝癌细胞HepG2的胰岛素抵抗

权晓娟，胡艳粉，梁春联，郑华东

(西安交通大学第二附属医院 老年内分泌科，陕西 西安 710004)

2型糖尿病是严重影响人类健康的疾病之一，其主要两大病理异常是胰岛素抵抗和胰岛素分泌受损[1]。胰岛素抵抗是葡萄糖代谢中胰岛素作用的主要机体靶组织(如骨骼肌、肝脏和脂肪)对胰岛素敏感性降低的一种病理状态。之前研究发现转录因子2(transcription factor 2, TCF2)可缓解棕榈酸诱导的胰腺β细胞损伤，促进胰岛素分泌[2]。然而，TCF2在肝脏胰岛素抵抗中的作用尚未见报道。本实验通过胰岛素诱导构建人肝癌HepG2细胞胰岛素抵抗模型，探讨TCF2过表达对胰岛素抵抗的影响，为研究胰岛素抵抗的分子机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 细胞及主要试剂

人肝癌HepG2细胞系(中国科学院上海细胞库)；DMEM培养基(Life Technologies公司)；胰蛋白酶(上海吉泰生物科技有限公司)；葡萄糖氧化酶试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司)；TCF2编码序列的腺病毒表达载体(Ad-TCF2-GFP)(上海吉凯基因技术公司构建并鉴定)；TCF2兔多克隆抗体(ProSci公司)；胰岛素受体底物(IRS- 1)兔多克隆抗体(Milipore公司)；葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)兔单克隆抗体(BD公司)；胰岛素、MTT和HRP标记的山羊抗兔二抗(Sigma公司)；胎牛血清、LipofetamineTM2000、Trizol试剂盒和反转录试剂盒均(Invitrogen公司)；SYBR Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒(TaKaRa公司)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(江苏碧云天生物技术研究所)；肝糖原测定试剂盒、己糖激酶测定试剂盒和丙酮酸激酶测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和分组：在10%胎牛血清的DMEM培养基，于5% CO237 ℃培养HepG2细胞，并分为空白组、胰岛素抵抗模型组(IR组)、IR+TCF2过表达组和IR+空载体组。空白组细胞正常培养，IR组培养液中加胰岛素培养24 h，IR+TCF2过表达组细胞和IR+空载体组细胞分别感染Ad-TCF2-GFP或Ad-GFP 48 h后，加入胰岛素培养24 h。

1.2.2 腺病毒感染：取对数增殖期的细胞接种到6孔板(5×104个/孔)，细胞增殖汇合至70%～80%，加75 MOI腺病毒载体(Ad-TCF2-GFP和Ad-GFP)。72 h后加嘌呤霉素(1.0 μg/mL)培养2 d，建立稳定过表达TCF2的细胞。以Ad-GFP为对照。

1.2.3 胰岛素抵抗模型的建立：参照文献[3]建立胰岛素抵抗模型。细胞增殖汇合至80%～90%，用无血清的DMEM培养液饥饿12 h，加入终浓度分别为1×10-5、1×10-6、1×10-7、1×10-8和1×10-9mol/L的胰岛素培养24 h。

1.2.4 葡萄糖消耗实验：按葡萄糖氧化酶试剂盒说明书操作，检测培养液中的葡萄糖浓度。以空白孔为参照，计算24 h各组细胞的葡萄糖消耗量。

1.2.5 细胞存活率检测：胰岛素培养HepG2细胞24 h后，用MTT法测定细胞存活率。

1.2.6 肝糖原合成量实验：按肝糖原测定试剂盒说明书操作，检测细胞糖原合成。

1.2.7 己糖激酶和丙酮酸激酶活性检测：按己糖激酶测定试剂盒和丙酮酸激酶测定试剂盒说明书进行操作，分别检测己糖激酶、丙酮酸激酶活性。

1.2.8 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测TCF2 mRNA表达：用Trizol提取细胞总RNA，反转录合成cDNA，以cDNA为模板，用荧光定量PCR扩增。TCF2上游引物序列：5′-CTCCCAGCATCTCAACA AGG-3′，下游引物序列：5′-CTGTCTGGTTGAATTGT CGG-3′；内参GAPDH上游引物序列：5′-ACCACA GTCCATGCCATCAC-3′，下游引物序列：5′-TTCACC ACCCTGTTGCTGTA-3′。反应体系按照SYBR-Premix Ex-Taq Ⅱ试剂盒说明书进行。反应条件为：94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环，72 ℃延伸5 min。以2-ΔΔCt法进行定量分析，实验重复3次。

1.2.9 Western blot检测TCF2、IRS- 1和GLUT4蛋白表达：提取细胞总蛋白，BCA法定量后进行SDS-PAGE电泳，随后转至PVDF膜上，封闭1 h后，用一抗TCF2(1∶500)、IRS- 1(1∶1 000)或GLUT4(1∶500)4 ℃孵育过夜。洗膜后加入二抗(1∶4 000)，室温孵育1 h。以GAPDH为内参。TBST漂洗后进行ECL显色和观察。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 胰岛素诱导HepG2细胞产生胰岛素抵抗

和空白组相比，不同浓度的胰岛素(除1×10-9mol/L外)处理24 h，HepG2细胞对葡萄糖的摄取均显著减少，细胞存活率呈胰岛素浓度依赖性下降(P<0.05)(表1)。因此选用显著减少葡萄糖消耗，且对细胞存活率影响最小的胰岛素浓度即1×10-8mol/L。

和空白组相比，胰岛素(1×10-8mol/L)作用24、48和72 h后，HepG2细胞对葡萄糖的摄取均显著降低(P<0.05)(表2)。因此，后续实验用1×10-8mol/L胰岛素作用24 h诱导HepG2细胞产生胰岛素抵抗。

2.2 TCF2在胰岛素抵抗HepG2细胞表达降低

1×10-8mol/L胰岛素处理24 h，TCF2 mRNA和蛋白的表达显著低于空白组(P<0.05)(图1)。

2.3 TCF2过表达的HepG2细胞株的鉴定

转染Ad-TCF2-GFP后，HepG2细胞TCF2 mRNA和蛋白的表达明显高于空白组和转染空载体组(P<0.05)(图2)。

表1 不同浓度胰岛素对HepG2细胞葡萄糖消耗和细胞活力的影响

*P<0.05 compared with control group.

表2 胰岛素作用不同时间对HepG2细胞葡萄糖消耗的影响

*P<0.05 compared with control group.

A.relative mRNA expression of TCF2 in HepG2 cells; B.relative protein expression of TCF2 in HepG2 cells;*P<0.05 compared with control group

A.TCF2 mRNA level in HepG2 cells with Ad-TCF2-GFP transfection detected by qPCR; B.TCF2 protein level in HepG2 cells with Ad-TCF2-GFP transfection detected by Western blot;*P<0.05 compared with control group or Ad-GFP transfection group

2.4 TCF2过表达改善HepG2胰岛素抵抗模型葡萄糖摄取

和空白组相比，IR组细胞葡萄糖消耗量显著降低(P<0.05)。与IR组比，TCF2过表达组胰岛素抵抗HepG2细胞葡萄糖消耗量显著升高(P<0.05)(图3)。

2.5 TCF2过表达对HepG2胰岛素抵抗模型糖代谢的影响

TCF2过表达明显提高胰岛素抵抗HepG2细胞肝糖原含量、己糖激酶活性和丙酮酸激酶活性(P<0.05)(图4)。

A.liver glycogen; B.hexokinase; C.pyruvate kinase; *P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with IR group

1.control group； 2.IR group； 3.Ad-GFP group； 4.Ad-TCF2-GFP group； *P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with IR group

2.6 TCF2过表达促进IRS- 1和GLUT4蛋白表达

TCF2过表达显著升高胰岛素抵抗HepG2细胞IRS- 1和GLUT4蛋白表达(P<0.05)(图5)。

3 讨论

胰岛素抵抗是导致2型糖尿病发展的关键因素[4]，减轻胰岛素抵抗是治疗2型糖尿病的关键途径。因此，深入研究胰岛素抵抗的机制，对2型糖尿病治疗具有重要意义。

TCF2基因又称HNF1β，广泛表达于胰腺和肝脏等器官[5]，在调控肝细胞分化、发育及代谢等方面发挥重要作用[6]。TCF2突变引起大量青少年起病的成年型糖尿病[7]。TCF2突变也与胰岛素分泌缺乏[8]和肝功能紊乱[9]等疾病相关。肝脏TCF2突变引起胰腺外分泌功能障碍和葡萄糖不耐受综合征，损害胰岛素信号通路，促进肝脏糖异生和糖尿病[10]。研究发现TCF2可缓解棕榈酸诱导的胰腺β细胞损伤，促进胰岛素分泌[2]。本实验用高浓度胰岛素诱导HepG2细胞建立胰岛素抵抗模型，发现TCF2在模型细胞中低表达，提示其可能在改善胰岛素抵抗发挥重要作用。为进一步研究TCF2的作用，构建含TCF2的过表达载体，发现TCF2过表达促进胰岛素抵抗HepG2细胞的葡萄糖摄取和糖代谢。

肝脏是葡萄糖代谢的主要器官，肝脏对葡萄糖的转运障碍是2型糖尿病胰岛素抵抗的重要原因。己糖激酶和丙酮酸激酶是糖代谢的关键酶。其中，己糖激酶可促进葡萄糖利用，丙酮酸激酶是糖酵解途径中的一个限速酶。本实验发现TCF2过表达可提高这两个酶的活性，增加肝糖原合成，表明TCF2可能是通过调节糖代谢，改善胰岛素抵抗。

IRS- 1与胰岛素受体结合后被磷酸化，激活GLUT4，促进葡萄糖的摄取和利用[11]。胰岛素抵抗会使IRS- 1和GLUT4损害，导致葡萄糖利用障碍[12]。本实验结果提示TCF2过表达可能通过促进IRS- 1的表达，起到降糖作用。

综上，本实验表明TCF2过表达可有效改善HepG2细胞胰岛素抵抗，为胰岛素抵抗的治疗提供了新靶点，对于2型糖尿病的防治新策略具有潜在应用价值。

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