miR-143靶向调控ER-α36影响胃癌细胞系SGC7901的侵袭

邹 丰, 罗媛媛，刘丽江*

(江汉大学 医学院 1.病理学与病理生理学教研室； 2.医疗系， 湖北 武汉 430056)

雌激素受体ER-α36(estrogen receptor-α36)作为近几年鉴定并克隆出的一种新型的雌激素受体，发挥着与经典的雌激素受体ER-α66完全不同的生物学功能[1]。ER-α36启动雌激素样信号传导主要通过细胞膜来完成，不仅能够调控乳腺癌等性激素依赖性肿瘤的生长[2]，也能介导胃癌等非性激素依赖性肿瘤的发生[3]。

microRNA是一类长度约为20～25 nt的小分子

单链RNA，具有高度保守的内源性非蛋白编码，其主要功能是通过对靶基因转录体的切割或翻译抑制来调控基因的表达[4]。前期研究证实，雌激素受体ER-α36不仅能在胃癌组织和胃癌细胞系中表达，也能促进胃癌细胞的侵袭，其机制可能与microRNA- 143(miR-143)有关[5]。本项研究将进一步用体外实验阐明miR-143通过靶向ER-α36调控胃癌细胞的侵袭。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞:人胃癌细胞系SGC7901(华中科技大学同济医学院免疫学系惠赠，为本实验室保存)。

1.1.2 试剂:ER-α36沉默质粒、ER-α36过表达质粒和ER-α36单克隆抗体(美国Creighton大学医学院肿瘤中心王兆一教授馈赠)；β-Actin抗体(Santa Cruz公司)；Transwell侵袭试剂盒(Millipore公司)；miR-143、内参U6的Taqman引物和探针(Applied Biosystems公司)；质粒抽提试剂盒和Dual-GloTMLuciferase Assay System(Promega公司)；Opti-MEM培养基(Invitrogen公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及分组处理：将人胃癌SGC7901细胞接种在含10%小牛血清的RPMI1640培养基中，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。每2～3 d待细胞增殖至70%～80%汇合时胰蛋白酶消化传代。

1.2.2 质粒构建：通过使用miRNA 抑制剂克隆导入细胞后表达miRNA抑制剂(miArrest) 和插入pre-miR143序列的方法构建miR-143沉默和miR-143表达的质粒，经转化大肠杆菌并测序验证。其目的载体选用GV159和GV272。慢病毒载体(lentiviral vectors,LV)系统由 GV 慢病毒载体系列、pHelper 1.0 载体和 pHelper 2.0 载体3质粒组成并包装生成上调/下调miR-143的慢病毒LV-miR-143和LV-anti-miR-143。用慢病毒的方法感染人胃癌SGC7901细胞系，荧光显微镜下观察EGFP荧光蛋白的变化。

1.2.3 Western blot检测ER-α36蛋白的表达：提取细胞胞质总蛋白。按BCA蛋白含量测定试剂盒说明进行蛋白定量，经SDS-PAGE分离后蛋白半干转印于PVDF膜，封闭后I抗分开孵育：分别加入ER-α36抗体和β-actin抗体，4 ℃过夜；洗膜后孵育II抗，室温1 h，洗膜后于暗室中行ECL显色检测蛋白的表达，采用数码凝胶图像处理系统扫描测定ER-α36和内参β-actin的表达(用平均吸光度值表示)。

1.2.4 Transwell小室实验检测SGC7901细胞的侵袭：采用Millpore试剂盒，按说明书操作。

1.2.5 生物信息学配对：利用microRNA的靶基因数据库(http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/)进行ER-α36基因的3′UTR区与miR-143的Seed Region(种子区)的配对分析。

1.2.6 荧光素酶检测ER-α36和miR-143的相关性：培养增殖状态良好的293T细胞，质粒转染前1 d，将细胞分入24-well培养板培养，转染当天按实验设计的组别进行质粒转染实验。转染24 h后荧光显微镜下观察细胞内荧光标记基因(如GFP)的表达情况，然后使用试剂盒处理细胞，进行luciferase表达检测。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白EGFP的表达

转染后miR-143 down组细胞和miR-143 up组细胞均能发出大量绿色荧光，且细胞情况良好，轮廓边缘清晰。对照组无荧光信号的产生(图1)。

2.2 沉默或过表达miR-143对SGC7901细胞ER-α36表达的影响

miR-143沉默组(miR-143 down)其ER-α36蛋白表达要明显高于对照组(P<0.05)；miR-143表达组(miR-143 up)其ER-α36蛋白表达要明显低于对照组和miR-143表达组(miR-143 up)(P<0.05)(图2)。

2.3 沉默或过表达miR-143对SGC7901细胞侵袭性的影响

与对照组细胞相比，miR-143沉默(miR-143 down)的侵袭性明显增强，而miR-143表达的质粒(miR-143 up)的侵袭性明显减弱(图3)。

2.4 miR-143与ER-α36的配对

ER-α36基因的3′UTR区与miR-143的Seed Region(种子区)有超过14对的碱基互补，可能成为miR-143的重要靶基因之一(图4)。

图1 慢病毒感染24 h细胞感染率Fig 1 Cell infection rate (24 hours after transfection, ×200)

*P<0.05 compared with CON group

图3 过表达miR-143抑制SGC7901细胞的侵袭，反之增加

图4 miR-143的种子区与ER-α36的3′端非编码区有14对碱基互补配对Fig 4 14 direct recognitions of the 3′-UTR of the mRNA of ER-α36 by miR-143

2.5 荧光素酶报告基因实验验证ER-α36和miR-143的关系

在野生型(WT cell)中，转染miR-143 表达组(miR-143 up)的荧光素酶表达量比转染对照类似物组明显下降(P<0.05)，而转染miR-143沉默组(miR-143 down)的荧光素酶表达量明显上升(P<0.05)；对ER-α36 3′UTR区的相应位点进行突变后的miR-143(MUT cell)不再影响荧光素酶的表达量。即证实miR-143可以直接与ER-α36 3′UTR区的特定位点以碱基互补配对方式结合，其序列在种属间高度保守，且其相互作用的亲和力较高(图5)。

*P<0.05 compared with miR-143 up NC group; #P<0.05 compared with miR-143 down NC group图5 荧光素酶报告基因实验证实miR-143负向调控ER-α36的表达Fig 5 Luciferase reporter assay confirmed the direct recognition of the 3′-UTR of ER-α36 by

3 讨论

探讨胃癌防治的分子机制具有重要的临床意义。MicroRNA是一类具有高度保守的内源性非蛋白编码的小分子单链RNA，其与肿瘤的发生和发展密不可分。前期研究工作发现：低浓度的雌激素促进胃癌细胞的侵袭，高浓度的雌激素抑制胃癌细胞的侵袭。胃癌的侵袭能力和雌激素受体ER-α36的表达呈正相关，其机制可能与miR-143的调控有关。

miR-143位于人类基因组5号染色体上，在多种生物中均有表达。miR-143最早被报道存在于小鼠胚胎的多能心脏祖细胞中，其功能是促进平滑肌细胞的分化并抑制其增生[6]。最近已有大量的证据显示miR-143与肿瘤的发生密切相关。miR-143表达的下调可以促进食管鳞状细胞癌的发生[7]。miR-143还能通过调控其靶基因DNA甲基转移酶3A蛋白来介导结直肠癌的发生[8]。miR-143与胃癌的发生也联系紧密。应用miRNAs芯片技术筛选了47例配对的胃癌和正常胃组织，对比差异发现有42个miRNA高表达，20个miRNA低表达。其中差异最显著的是miR-143[9]。通过胃癌组织和癌旁正常组织与SGC7901胃癌细胞的对比发现，miR-143可通过抑制鸟成红细胞增多癌基因- 3(ERBB3)的表达抑制胃癌细胞的增殖与迁移[10]。虽然不同的研究者针对的靶向调控基因不同，但与本研究结果一致的是，miR-143都参与了抑制胃癌的发生，提示miR-143有一定的分子靶向治疗前景。

miR-143的水平也会随着胃癌的发展过程发生显著的改变。82例晚期接受含紫杉醇联合铂类或氟尿嘧啶类药物的胃癌患者的血清标本中miR-143的水平与同期76名健康体检者的miR-143水平相比后显著降低，提示晚期胃癌血清miR-143水平明显低于正常值，且与含紫杉醇方案化疗敏感性及预后均有关[11]。推测出miR-143的水平改变对于肿瘤的评估已有一定的临床意义。此外，另一种非编码RNA的lncRNA在胃癌中的研究愈来愈热[12]。LncRNA还能与miRNA相互调节来促进或抑制肿瘤的发生[13]。因此，下一阶段还会对在胃癌中表达差异的lncRNA进行相关研究，并探讨与miRNA尤其是miR-143之间的关联。

综上所述，本研究结果显示：miR-143通过靶向雌激素受体ER-α36负向调控胃癌细胞SGC7901的侵袭。

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