LC-MS/MS法测定家兔血浆中奥昔布宁浓度及其在生物等效性评价中的应用

沈 沅，陈忠杰，曾梦华

(重庆医科大学附属第一医院 1.药学部； 2.胃肠外科, 重庆 400016； 3.重庆医药工业研究院, 重庆 400060)

盐酸奥昔布宁(oxybutynin hydrochloride)作为第3代治疗尿失禁首选药物，具有温和的抗胆碱能力和很强的抗平滑肌痉挛作用，对泌尿生殖道平滑肌有较强选择性[1]。盐酸奥昔布宁经口服吸收迅速，但存在首过代谢明显等不利特点[2]。2009年美国FDA批准奥昔布宁凝胶制剂Gelnique上市[3]，它通过经皮给药避免了以上药动学缺陷，可获得稳定的血药浓度，成为国内研制奥昔布宁经皮给药的标准参照制剂。

由于目前国内尚无奥昔布宁经皮给药制剂上市，研制奥昔布宁经皮给药具有重大的临床意义和经济价值，大量制剂研究成为热点[4- 5]。其中由于凝胶剂使用方便且不易引起瘙痒等皮肤刺激，成为新剂型开发的首选[3]。

为了研究盐酸奥昔布宁凝胶的非临床药动学特点，实验选用家兔为经皮给药模型动物。已报道的血浆奥昔布宁测定方法主要以液-液萃取[6]和固相萃取法[7]处理样品。本研究经过综合考察，建立了专属性强，灵敏度好、准确性高且简便和经济的测定家兔血浆中奥昔布宁浓度的方法，完成了自制品与国外上市制剂Gelnique的非临床生物等效性评价。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂：盐酸奥昔布宁对照品(威海迪素制药有限公司)；盐酸苯海拉明对照品(中国药品生物制品检定所)；自制盐酸奥昔布宁凝胶(重庆医药工业研究院有限责任公司)；盐酸奥昔布宁凝胶国外上市品Gelnique(Watson公司)；甲醇和乙腈(国药集团化学试剂有限公司)；叔丁基甲醚(Sigma-Aldrich公司)。

1.1.2 实验动物：16只普通级雄性新西兰白兔，体质量2～2.5 kg[重庆市中药研究院实验动物研究所，生产许可证号：SCXK(渝)2012- 0007]，在重庆医药工业研究院有限责任公司动物房饲养2周后进行实验。

1.2 方法

1.2.1 色谱和质谱检测条件：色谱柱采用Kinetex C18100A柱(2.1 mm×50 mm，2.6 μm，Phenomenex)；流动相为水相(1‰甲酸- 10 mmol/L乙酸铵缓冲液)-乙腈50:50 (V/V)，流速0.2 mL/min。采用(+)ESI模式获得离子原，参数如下：Capillary 4 000 V, Gas flow 9 L/min, Neb Press 30 psi, Gas Temp 300 ℃。多反应检测(multiple reaction monitoring, MRM)模式下定量，参数如下：奥昔布宁的transition为m/z 358.3→142.1，Fragmentor 135,Collision 为20；苯海拉明的transition为m/z 256.1→167.2，Fragmentor 135,Collision 为5。奥昔布宁和内标苯海拉明的质谱图(图1)。

1.2.2 标准品溶液配制：称取盐酸奥昔布宁20.2 mg，甲醇溶解并稀释成浓度为10、50、100、250、500、1 000和2 000 μg/L的系列标准工作溶液。称取内标盐酸苯海拉明20.1 mg, 甲醇溶解并稀释为50 μg/L的内标工作溶液。

1.2.3 血浆标准曲线及质控样品配制：取7份空白家兔血浆，每份0.45 mL，分别加入盐酸奥昔布宁系列标准工作液50 μL，得浓度梯度为200、100、50、25、10、5和1 μg/L 的含药血浆溶液。同样，制备血浆高、中和低浓度(200、25和1 μg/L)质控样品(quality control, QC)，用于方法学考察和随行样本测定。

1.2.4 血浆样品处理：取家兔血浆样品0.5 mL置于10 mL玻璃离心管中，加入50 μL含50 μg/L盐酸苯海拉明的内标工作溶液，涡旋混合10 s。离心管中加入0.5 mol/L的NaOH水溶液50 μL碱化血样，混合后再加入叔丁基甲醚5 mL，充分涡旋1.5 min后, 3 000 r/min离心5 min。准确移取上清液4 mL于另一离心管中，氮气吹干。残渣用100 μL流动相复溶，取20 μL进行测定。

1.2.5 方法学验证：生物样本测定方法学的验证按照国家食品药品监督管理局颁布的指导原则执行[8]。分别对家兔空白血浆，空白血浆+盐酸奥昔布宁+内标样品，家兔给药后血浆+内标样品进行测定。色谱图中无内、外源性物质干扰奥昔布宁和内标苯海拉明的测定即视为方法特异性合格。

将血浆标准曲线样品按1.2.4项测定后， 以奥昔布宁峰面积与内标(internal standard, I.S.)峰面积之比为纵坐标，对应的血浆盐酸奥昔布宁浓度为横坐标作图并进行加权最小二乘法回归拟合，计算相关系数r和标准曲线方程；以标准曲线最低点作为最低定量限(lower limit of quantitation, LLOQ)。

图1 奥昔布宁(A)和内标苯海拉明(B)的全扫描质谱图Fig 1 Full scan mass spectrum of oxybutynin (A) and diphenhydramine (B)

配制QC血浆样品，每个浓度5份样本，按1.2.4项处理并连续进行3个批次的测定，用标准曲线计算出各浓度，考察批内和批间精密度和准确度。

配制QC样品各5份，按照1.2.4项对每份样品进行液-液萃取，进样测定并记录峰面积A；另用流动相配制与QC浓度一致的盐酸奥昔布宁溶液，直接进样分析得峰面积B；再将以上盐酸奥昔布宁溶液加入到空白血浆提取后的残留物(基质)中，混合后进样测定并记录峰面积C。色谱峰面积A/C×100%为奥昔布宁的提取回收率，色谱峰面积C/B×100%为奥昔布宁的基质效应。实验还分别测定了QC浓度含药血浆在室温(12 h)、冷冻(-40 ℃，30 d)和两次冻融(-40 ℃～25 ℃)条件下的稳定性和血浆经预处理后仪器内放置24 h 的稳定性。

1.2.6 家兔生物等效性实验:动物试验采用平行设计，随机分为T和R两组。T组家兔，于背部物理脱毛后给予自制盐酸奥昔布宁凝胶，R组家兔以相同方法给予Gelnique，单次给药0.5 mL，约含盐酸奥昔布宁0.44 g。于给药前及给药后10、20及40 min和1、2、4、6、8、12、16、20、24、30、36及48 h于家兔耳缘静脉处取血1.5 mL，肝素抗凝，3 000 r/min离心5 min后分离血浆，置-40 ℃冰箱内保存待测。

1.3 数据处理与药动学参数计算

用EXCEL软件对方法学考察数据进行分析计算，精密度用相对标准偏差(RSD)表示，准确度用实测浓度与理论浓度比值(%)表示。采用DAS2.0软件进行药物动力学参数拟合，绘制药时曲线。对受试组和参比组AUC0-t、AUC0-∞及Cmax进行双向单侧t检验及(1-2a，a=0.05)置信区间法等效分析，对tmax进行Wilcoxon非参数检验，评价自制凝胶和Gelnique的生物等效性。

2 结果

2.1 分析方法学验证

2.1.1 特异性与线性:奥昔布宁和苯海拉明的保留时间分别为2.7和1.9 min，待测浓度范围内，色谱曲线平滑无内外源性物质干扰(图2)。盐酸奥昔布宁的线性范围为1 μg/L～200 μg/L，最低定量限为1 μg/L。标准曲线方程y=0.0014c+0.007(r=0.9977)。

A.a blank rabbit plasma sample; B.a rabbit plasma spiked with oxybutynin (50 μg/L) and diphenhydramine (5 μg/L); C.a rabbit plasma sample from 2 h after administration of oxybutynin chloride gel spiked with IS

图2LC/MS/MS法测定血浆中奥昔布宁和内标苯海拉明的典型MRM色谱图
Fig2TypicalMRMchromatogramsofoxybutyninanddiphenhydramine(IS)inrabbitplasmabyLC-MS/MS

2.1.2 灵敏度、精密度、准确度和稳定性:各浓度水平QC样品的批内RSD介于2.13%～6.29%，批间RSD介于1.67%～9.79%，准确度在92.9%～103%；在LLOQ浓度下的批内和批间RSD值分别为6.29%和9.79%，准确度为92.9%，均符合样品分析要求。含药血浆样品在室温、冷冻、冻融及血浆处理后仪器中放置24 h等条件下表现出良好的稳定性，准确度在94.8%～104%，RSD均小于11.4%，符合分析方法验证要求(表1)。

2.1.3 提取回收率与基质效应:3个质控水平的奥昔布宁提取回收率在67.5%～78.6%。基质效应范围介于91.3%～104.1%。本测定方法的提取回收率和基质效应均满足样品分析的要求(表2)。

表1 LC-MS/MS法测定家兔血浆奥昔布宁的准确度、精密度和稳定性Table 1 Accuracy, precision, and stability of oxybutynine in rabbit plasma by n=5)

表2 LC-MS/MS法测定奥昔布宁的提取回收率和基质效应

2.2 透皮制剂家兔生物等效性研究

实验测定了T和R两组家兔单次经皮给药后48 h内的血浆奥昔布宁浓度。采用DAS2.0软件，非房室模型计算药代动力学参数，平均药时曲线(图3)和药代动力学参数(表3)。

图3 自制盐酸奥昔布宁凝胶(T组)与Gelnique(R组)家兔平均药时曲线图Fig 3 Mean plasma concentration-time profile of oxy- butynin after administration of test oxybutynin chloride gel (T group) and reference product Gelnique (R group) to n=8)

parameterTmax/hourt1/2/hourCmax/(μg/L)AUC0-t/(μg/L·h)test product1.46±0.599.2±5.6112.4±19.41 232±140reference product1.79±1.088.2±3.2122.6±28.31 347±389

AUC0-t的(1-2a)%置信区间为96.5%～101.9%，Cmax的(1-2a)%置信区间为94.9%～101.9%，均落于等效标准80%～125%[9]。以上结果表明，采用平行设计，家兔单剂量经皮给予0.44 g奥昔布宁凝胶后，自制凝胶和Gelnique具有生物等效性。

3 讨论

为建立一种简便、选择性好和灵敏度高的LC-MS/MS方法，本研究进行了大量条件摸索与优化。通过对乙酸乙酯、乙醚、叔丁基甲醚和正己烷等几种有机液的比较，选择了提取回收率高、挥发性好、残余物背景干净的叔丁基甲醚作为萃取液。与报道的反萃取方法[6]相比，本方法步骤简单且快速。与报道的固相萃取法[7]相比操作简便，耗时短，且无需消耗价格昂贵的萃取小柱。

目前用于药物透皮吸收评价的常用实验动物有大鼠、豚鼠、猪及家兔等[10]。据报道[11]，确定采用体型较大、价格便宜和操控性较好的新西兰白兔为实验动物。设定给药部位为家兔背部，用电动剃刀脱毛，再将药物涂敷于裸露皮肤。为防止家兔舔舐抓挠给药部位，需固定在兔盒中一段时间，待凝胶挥干后方可放回笼内。

本实验设计达峰前3个采样点，采血时间持续到48 h，可覆盖家兔药动学的吸收、分布和消除相。家兔给药后，奥昔布宁吸收迅速，达峰时间约1.5 h，之后血药浓度下降，并在4～16 h呈现一个稳定状态，20 h后血药浓度缓慢下降。原因可能是家兔皮肤渗透性比人体皮肤大，在含10%乙醇凝胶的促渗作用下奥昔布宁被迅速吸收，待乙醇挥发后，奥昔布宁吸收进入家兔体内的速度放缓，药时曲线呈现一段平台期，最后缓慢消除。比较自制凝胶和Gelnique在家兔体内的药动学曲线，两者具有相似的透皮吸收特征。

奥昔布宁透皮制剂相对于口服制剂有着明显的药动学和药效学优势，且使用方便，顺应性好。本文建立的LC-MS/MS法成功应用于奥昔布宁透皮凝胶的家兔药代动力学研究，并为同类仿制制剂提供了国外上市品的家兔药动学数据参照。

参考文献：

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