血清标本保存条件及反复冻融对胃蛋白酶原检测结果影响

余国庆 孙红 周丽玲 余南俊 赵越

【摘要】 目的：分析血清样本保存温度、保存时间及反复冻融对胃蛋白酶原Ⅰ（PGⅠ）、胃蛋白酶原Ⅱ（PGⅡ）检测结果的影响。方法：收集体检血清样本40份，使用全自动生化仪采用胶乳增加免疫比浊法定量检测血清中胃蛋白酶原Ⅰ、胃蛋白酶原Ⅱ的浓度作为第0天或者第0次的结果。将每份标本分成16份，每5份为一组，分别置于25 ℃、4 ℃、-20 ℃环境保存，分别在保存后的1、3、6、10、15 d取出检测血清PGⅠ、PGⅡ浓度；另外1管置于-20 ℃冰箱冻存，2～3 h后再解冻进行PGⅠ、PGⅡ检测，测完成后立即于-20 ℃进行冻存，如此反复冻存6次，将25 ℃、4 ℃、-20 ℃不同保存天数及反复冻融PGⅠ、PGⅡ浓度检测结果与对照组结果进行比较。结果：血清PGⅠ在25 ℃、4 ℃、-20 ℃条件下保存3 d浓度未发生显著变化；PGⅡ在25 ℃、4 ℃保存条件下稳定3 d，在-20 ℃条件下保存6 d浓度无显著降低。血清PGⅠ在第2次冻融后浓度显著降低，PGⅡ浓度在第3次冻融后显著下降。结论：PGⅠ在25 ℃、4 ℃、-20 ℃条件下均能保存3 d，PGⅡ在-20 ℃保存较25 ℃、4 ℃保存时间长，PGⅠ、PGⅡ冷冻保存需避免反复冻融。

【关键词】 胃蛋白酶原Ⅰ； 胃蛋白酶原Ⅱ； 标本保存

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2018.7.034 文献标识码 B 文章编号 1674-6805（2018）07-0073-03

胃蛋白酶原（pepsinogen，PG）是胃液中胃黏膜分泌的无活性胃蛋白酶前体，根据其免疫原性、生化性质及组织细胞来源及分布可分为胃蛋白酶原Ⅰ（PGⅠ）、胃蛋白酶原Ⅱ（PGⅡ），PG在胃中可以辅助消化食物，约有1%进入到血液中[1-2]。血液中PGⅠ、PGⅡ浓度及PGⅠ/PGⅡ比值在诊断慢性萎缩性胃炎有较高的特异性和敏感性，而慢性萎缩性胃炎是胃癌的主要癌前病变[3]。研究发现PG与胃癌关系密切，已作为胃癌早期筛查的一个重要指标，日本学者已将PGⅠ<70 g/L，PGⅠ/PGⅡ比值<3.0作为胃癌筛查的截断值[4]。目前，临床上检测PGⅠ、PGⅡ的方法较多，有ELISA双抗夹心法、免疫比浊法、化学发光法，但有关PGⅠ、PGⅡ血清样本保存温度、保存时间及反复冻融对检测结果的影响报道并不多见。本研究主要分析PGⅠ、PGⅡ的血清样本保存条件，为分析质量检验控制提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

随机选取到笔者所在医院体检者40例，其中男38例、女2例，年龄22～55岁，平均（34.2±8.37）岁。所有入选者均被告知抽取血标本用于胃蛋白酶原保存条件研究，且研究并经医院伦理委员会批准。

1.2 方法

所选体检对象均于清晨空腹抽静脉血进行检测，每位体检者使用普通真空管抽取2管血，每管5 ml，3 000 r/min离心10 min，制备血清（共3.75 ml），立即采用胶乳增加免疫比浊法（采用日立7180全自动生化分析仪）定量检测血清中胃蛋白酶原Ⅰ、胃蛋白酶原Ⅱ的浓度作为第0天或第0次的结果，随后分离血清进行分装，每个体检标本分装为16份，其中15份每份150μl，每5份分为一组，分别放置于25 ℃、4 ℃、-20 ℃条件下保存，并于放置后的1、3、6、10、15 d检测PGⅠ、PGⅡ；另一份血清为1.5 ml，置于-20 ℃冰箱冻存，2～3 h后再解冻进行PGⅠ、PGⅡ检测，测完成后立即于-20 ℃进行冻存，如此反复冻存6次。将25 ℃、4 ℃、-20 ℃不同保存天数及反复冻融后PGⅠ、PGⅡ浓度检测结果与第0天或第0次的结果进行比较，同时计算相对于第0天或第0次结果的变化率，变化率=（第n天-第0天）/第0天×100%，或者变化率=（第n次-第0次）/第0次×100%。PGⅠ、PGⅡ试剂及校准品均由宁波美康生物科技有限公司提供。所有数据检测均遵照本科室SOP文件操作规程，质控在控制范围内，依正常流程送检。

1.3 统计学处理

本研究数据采用SPSS 16.0统计学软件进行分析和处理，符合正态分布的计量资料以（x±s）表示，采用配对t检验，不符合正态分布的计量资料以M（Q1，Q3）表示，采用秩和检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同温度不同保存时间血清PGⅠ浓度结果

PGⅠ在25 ℃、4 ℃、-20 ℃均能稳定3 d，保存第6天的浓度均显著降低，差异有统计学意义（P<0.05），随保存时间延长PGⅠ浓度下降，PGⅠ浓度下降率增大，6 d后，标本-20 ℃保存时PGⅠ浓度下降小于25 ℃及4 ℃保存条件，C差异均有统计学意义（P<0.05），见表1、表2。

2.2 不同温度不同保存时间血清PGⅡ浓度结果

PGⅡ在25 ℃、4 ℃保存条件下稳定3 d，在-20 ℃保存条件下稳定6 d。超出稳定天数，PGⅡ浓度随时间延长而下降，差异均有统计学意义（P<0.05），见表3。在-20 ℃条件保存PGⅡ血清标本6～15 d，其PGⅡ下降率低于25 ℃及4 ℃保存，差异均有统计学意义（P<0.05），见表4。

2.3 反复冻融对血清PGⅠ、PGⅡ浓度影响

血清PGⅠ在第2次冻融后浓度显著降低，PGⅡ浓度在第3次冻融后显著下降，且PGⅡ浓度变化率受反复冻融降低程度低于PGⅠ，差异均有统计学意义（P<0.05）见表5、表6。

3 讨论

血清胃蛋白酶原Ⅰ、胃蛋白酶原Ⅰ/胃蛋白酶原Ⅱ比值应用于慢性萎缩性胃炎的诊断已有数十年的历史。相关报道指出，低水平的胃蛋白酶原Ⅰ及胃蛋白酶原Ⅰ/胃蛋白酶原Ⅱ比值与慢性萎缩性胃炎密切相关，并且胃蛋白酶原Ⅰ及胃蛋白酶原Ⅰ/胃蛋白酶原Ⅱ比值能够预测胃癌的风险[5]。血清胃蛋白酶原Ⅰ水平和胃蛋白酶原Ⅰ/胃蛋白酶原Ⅱ比值联合应用可能有助于胃癌的早期诊断[6-7]。文献[8]报道，早期和晚期胃癌患者胃蛋白酶原Ⅰ和胃蛋白酶原Ⅰ/胃蛋白酶原Ⅱ比值较正常人群水平显著降低，而胃和十二指肠溃疡的患者胃蛋白酶原Ⅰ水平显著升高，与萎缩性胃炎患者相比，早期和晚期胃癌患者胃蛋白酶原Ⅰ和胃蛋白酶原Ⅰ/胃蛋白酶原Ⅱ比值水平更低；當以胃蛋白酶原Ⅰ 70 μg/L和胃蛋白酶原Ⅰ/胃蛋白酶原Ⅱ比值6作为截断水平诊断胃癌的敏感性和特异性分别是62.1%和94.2%。胃蛋白酶原Ⅰ、胃蛋白酶原Ⅱ、胃蛋白酶原Ⅰ/胃蛋白酶原Ⅱ比值有助于慢性萎缩性胃炎及胃癌早期诊断，但国外文献[9]报道称，检测方法不同试剂厂商不同会导致胃癌风险分级的不一致。同样，不同的保存条件和标本的转运条件等分析前因素也可能对胃蛋白酶原Ⅰ、胃蛋白酶原Ⅱ检测结果造成影响。

目前约70%检验误差来自分析前检验标本的质量影响产生的误差，检验标本质量好坏也是影响检验结果最大的不确定因素[10-11]。本研究结果显示，不同温度及不同保存时间血清胃蛋白酶原Ⅰ浓度均能稳定3 d，由于本试验设计未进行连续每天检测，故只能发现第6天PGⅠ浓度变化显著，但胃蛋白酶原Ⅰ浓度下降幅度小，三种温度均不到2%，15 d内变化幅度小于5%。PGⅡ浓度在3 d内不同温度保存均很稳定，随着时间延长降解幅度变大。可能与保存时间不断延长，血清标本中的胃蛋白酶原Ⅰ、胃蛋白酶原Ⅱ抗原效价降低有关，本研究采用分离血清检测胃蛋白酶原Ⅰ、胃蛋白酶原Ⅱ浓度，不受标本血细胞破碎溶血等因素影响，避免了对抗原抗体反映的非特异性吸附，可能这也是胃蛋白酶原Ⅰ、胃蛋白酶原Ⅱ浓度下降，但下降幅度较小的原因[12]。另外胃蛋白酶原Ⅰ、胃蛋白酶原Ⅱ在-20 ℃条件保存浓度没有25 ℃、4 ℃保存下降明显，可能是低温降低了细菌繁殖代谢的速度，因而增加长期稳定性。

本文除研究保存时间及温度对血清标本中胃蛋白酶原Ⅰ、胃蛋白酶原Ⅱ浓度影响外，还对标本进行反复冻融，研究发现冻融第2次后胃蛋白酶原Ⅰ浓度即显著改变，冻融6次后浓度变化率为-11.04（-12.22，-9.76）%；而胃蛋白酶原Ⅱ冻融3次后浓度才显著降低，且冻融6次后浓度变化率为-2.55（-3.40，-1.53）%。说明反复冻融对胃蛋白酶原Ⅰ、胃蛋白酶原Ⅱ浓度均有影响，但对胃蛋白酶原Ⅰ浓度影响更明显。可能反复冻融更易导致胃蛋白酶原Ⅰ抗原活性降低或者蛋白质结构破坏，最终导致检测浓度的下降。

综上所述，血清胃蛋白酶原Ⅰ、胃蛋白酶原Ⅱ检测宜尽快检测，需要更长时间保存应最好存放在-20 ℃条件下。另外，冻存标本应尽量避免反复冻融后检测，以免造成胃蛋白酶原Ⅰ、胃蛋白酶原Ⅱ浓度降低。

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（收稿日期：2017-09-12）