山姜素抑制卵巢癌OVCAR—8细胞增殖迁移及其机制研究

曾静 王璟 殷金凤 宋琦

[摘要] 目的 探討山姜素对人卵巢癌OVCAR-8细胞的增殖、迁移的抑制作用及其可能机制。 方法 以DMSO为溶剂对照，使用不同浓度山姜素（25、50、100、200和400 μmol/L）处理OVCAR-8不同时间（24、48和72 h）后，采用CCK-8试剂盒检测细胞增殖活力；采用3D肿瘤微球形成实验检测50 μmol/L山姜素处理7 d后肿瘤微球形成能力；使用划痕实验检测100 μmol/L山姜素处理24 h后对迁移能力；采用Western blot法检测不同浓度山姜素（50、100和200 μmol/L，以DMSO为对照）作用48 h后OVCAR-8细胞STAT3信号通路及凋亡相关蛋白表达变化。 结果 25～400 μmol/L山姜素对OVCAR-8细胞增殖均有抑制作用，且呈剂量-时间依赖效应关系（均P < 0.05）；50 μmol/L山姜素处理组肿瘤微球直径较DMSO组明显减小（P < 0.05），而100 μmol/L山姜素组划痕宽度明显宽于DMSO对照组（P < 0.05）；此外，50、100和200 μmol/L山姜素处理组Bax、cleaved-caspase-3和-9的表达明显增加，Bcl-2、p-STAT3、c-myc、survivin蛋白表达明显减少，均呈一定的剂量依赖效应关系（均P < 0.05）。而STAT3蛋白水平无明显变化（P > 0.05）。 结论 山姜素对卵巢癌OVCAR-8细胞增殖和迁移具有抑制作用，且可能与STAT3信号通路抑制以及线粒体凋亡通路激活相关。

[关键词] 山姜素；卵巢癌；增殖；迁移；微球；凋亡

[中图分类号] R711.75 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）04（a）-0013-05

[Abstract] Objective To explore the effect of alpinetin on human ovarian cancer cell line OVCAR-8 and its mechanism. Methods OVCAR-8 cells were treated with different concentrations of alpinetin （25， 50， 100， 200 and 400 μmol/L， DMSO as control） for different hours （24， 48 and 72 h）， then cell viabilities were detected by CCK-8 assays. 3D spheroid assay was used to measure the spheroid formation capacity of OVCAR-8 cell after treated with 50 μmol/L alpinetin （DMSO as control） for 7 days. Besides， wound healing assay was used to measure the migration capacity of OVCAR-8 cell after treated with 100 μmol/L alpinetin （DMSO as control） for 24 h. In addition， Western blot was used to detect the protein levels of STAT3 signaling related and apoptosis related proteins in OVCAR-8 cells after alpinetin treatments （50， 100 and 200 μmol/L， DMSO as control） for 48 h. Results 25-400 μmol/L alpinetin had remarkable inhibiting effects on OVCAR-8 cells and in a dose-and time-dependent manner（all P < 0.05）. After 7 days′ treatment， the diameter of spheroid in 50 μmol/L alpinetin group was significantly shorter than DMSO control group （P < 0.05）. Besides， the width of wound in 100 μmol/L alpinetin group was significantly longer than DMSO control group after treatment for 24 h （P < 0.05）. In addition， the protein levels of Bcl-2， p-STAT3， c-myc and survivin were decreased in 50， 100 and 200 μmol/L group of OVCAR-8 cells than DMSO control group after 48 exposure. On the contrary， the protein level of Bax， cleaved-caspase-3 and -9 was increased （all P < 0.05）， and there were no significantly changes in STAT3 levels （P > 0.05）. Conclusion Alpinetin can inhibit the proliferation and migration of OVCAR-8 cells，its mechanism may be related to the inhibition of STAT3 signaling pathway and the activation of mitochondrial apoptosis signaling.

[Key words] Alpinetin； Ovarian cancer； Proliferation； Migration； Spheroid； Apoptosis

卵巢癌是死亡率最高的妇科恶性肿瘤，也是女性癌症相关死亡的第五大常见原因[1]。其治疗主要是以铂类药物为核心的化学治疗，近年来化疗药物耐药成为卵巢癌复发和死亡率上升的重要因素，因此发现新的抗卵巢癌药物一直以来都是卵巢癌研究的热点之一。山姜素是提取自草豆蔻根茎或种子的一种天然类黄酮类物质。具有镇痛、抗炎和抗氧化作用[2]。近年来，国外有研究者将山姜素运用于抗肺癌及消化道等肿瘤的研究中[3-7]，并证实其抗肿瘤作用，但其对卵巢癌细胞的作用及其机制尚不明确。因此，研究山姜素对人卵巢癌细胞的作用及其分子机制，对抗卵巢癌新药发现具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和设备

山姜素（Alpinetin）购于成都曼斯特生物科技有限公司（A1051，HPLC纯度≥98%）；RPMI1640培养基、磷酸盐缓冲液（PBS，20012027）、胎牛血清购于美国赛默飞世尔科技有限公司；RAPI裂解液（P0013B）、CCK-8试剂盒（C0038）和BCA试剂盒（P0012）购于碧云天生物技术有限公司；抗GAPDH（2188R）、β-actin（0061R）、STAT3（1141R）、p-STAT3（1658R）、c-myc（4963R）、Survivin（0615R）、Bcl-2（0032R）和Bax（20386R）一抗購自北京博奥森生物技术有限公司；抗cleaved-caspase-3（9664）和cleaved-caspase-9（20750）购自美国CST公司；羊抗兔荧光二抗（C40109-04）购于美国LI-COR公司；CO2培养箱为德国BINDER公司产品（BD53型）；倒置显微镜为日本OLYMPUS公司产品（CKX31型）；酶标仪为美国PerkinElmer公司产品（1420型）；电泳电转仪为北京六一仪器厂产品（DYCZ-40D型）；双色红外激光成像系统为美国LI-COR公司产品（Odyssey）。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 人卵巢癌OVCAR-8细胞购于博奥派克生物有限公司（BI0-247），培养于RPMI1640培养基（含10%胎牛血清、青霉素100 U/mL和链霉素100 μg/mL），于5%CO2、37℃恒温培养箱中培养。

1.2.2 细胞增殖活力检测 OVCAR-8细胞以3×103细胞/孔接种于96孔板，24 h后更换含不同浓度山姜素的培养基100 μL。药物浓度分别为25、50、100、200和400 μmol/L，以DMSO为溶剂对照组，分别于24、48、72 h更换CCK-8检测试剂100 μL（90 μL RMPI1640培养基+10 μL CCK-8液），于5%CO2、37℃培养箱中孵育4 h，用酶标仪在450 nm波长检测各孔的吸光度值（A）。实验重复3次。计算细胞增殖活力：细胞活力（%）=（实验组平均A值/对照组平均A值）×100%。

1.2.3 3D肿瘤微球形成实验 OVCAR-8细胞以3×103细胞/孔接种于每孔含5 μL胶原蛋白的超低黏附96孔板，24 h后采用倒置显微镜拍照，拍照后加入山姜素（50 μmol/L），以DMSO为对照；7 d后再次拍照记录，计算肿瘤微球直径。

1.2.4 划痕实验 OVCAR-8细胞以2×105细胞/孔接种于六孔板，待细胞长至完全融合后采用200 μL枪头在中央划痕，PBS冲洗后采用倒置显微镜拍照；换液后用100 μmol/L处理24 h，以DMSO为对照，再次使用倒置显微镜拍照，计算划痕宽度。

1.2.5 Western blot 以DMSO为对照，采用不同浓度（50、100和200 μmol/L）山姜素处理OVCAR-8细胞48 h，随后使用RIPA裂解液（含1%苯甲基磺酰氟）提取细胞蛋白，使用BCA法测定蛋白样品浓度。以每孔30 μL蛋白体系，行10% SDS-PAGE凝胶电泳并电转移至PVDF膜；3%脱脂奶粉封闭1 h，一抗4℃摇床孵育过夜；洗膜后加入荧光山羊抗兔二抗室温摇床孵育1 h；洗膜后于双色红外激光成像系统扫描收集荧光信号。以GAPDH或β-actin为内参照，采用QuantityOne-v4.6.2软件对Western条带进行定量分析。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Dunnet t法，组内两两比较采用Tukey法，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 山姜素对卵巢癌OVCAR-8细胞增殖活力的作用

与DMSO对照组比较，采用25、50、100、200和400 μmol/L山姜素处理卵巢癌OVCAR-8细胞24、48和72 h后，细胞活力明显下降，增殖受到明显抑制，且呈剂量-时间依赖效应关系，差异均有统计学意义（P < 0.05）。见图1。

2.2 山姜素对卵巢癌OVCAR-8细胞肿瘤微球形成的影响

与DMSO对照组比较，50 μmol/L山姜素处理卵巢癌OVCAR-8细胞7 d后，肿瘤微球直径明显减小，差异均有统计学意义（P < 0.05）。见图2。

2.3 山姜素对卵巢癌OVCAR-8细胞迁移的影响

100 μmol/L山姜素处理卵巢癌OVCAR-8细胞24 h后，划痕宽度明显大于DMSO对照组，细胞迁移能力明显受到抑制，差异均有统计学意义（P < 0.05）。见图3。

2.4 山姜素对卵巢癌OVCAR-8细胞STAT3信号通路的影响

与DMSO对照组比较，各处理组STAT3蛋白水平无明显变化（P > 0.05），而50、100、200 μmol/L山姜素作用48 h后，p-STAT3、c-myc以及Survivin蛋白表达明显减少（P < 0.05）。此外，与50 μmol/L组比较，100 μmol/L组细胞p-STAT3、c-myc以及Survivin蛋白表达明显减少（P < 0.05），同时，与100 μmol/L组比较，200 μmol/L组细胞p-STAT3和c-myc蛋白表达下调（P < 0.05），Survivin蛋白水平差异无统计学意义（P > 0.05）。因此，山姜素能下调p-STAT3、c-myc以及Survivin蛋白表达，且呈现一定的剂量依赖效应关系。见图4。

2.5 山姜素对山姜素对卵巢癌OVCAR-8细胞凋亡相关蛋白表达的影响

与DMSO对照组比较，50 μmol/L山姜素作用48 h后，Bcl-2蛋白水平明显减少、Bax和cleaved-caspase-9蛋白水平明显增加（P < 0.05），而cleaved-caspase-3蛋白水平差异无统计学意义（P > 0.05）。此外，与50 μmol/L组比较，100 μmol/L组细胞Bcl-2蛋白水平明显减少，Bax和cleaved-caspase-3，cleaved-caspase-9蛋白水平明显增加（P < 0.05）。同时，与100 μmol/L组比较，200 μmol/L组细胞cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9蛋白水平明显增加（P < 0.05），Bcl-2和Bax蛋白水平差异无统计学意义（P > 0.05）。因此，山姜素能下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，增加促凋亡蛋白Bax和cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9蛋白水平，且呈现一定的剂量依赖效应关系。见图5。

3 讨论

卵巢癌因其发现是多为晚期，是女性死亡率最高的生殖道恶性肿瘤，严重威胁女性的健康[1]。山姜素是提取自草豆蔻根茎或种子的一种天然类黄酮类物质，研究表明山姜素对于多种肿瘤细胞具有较强的抑制作用[2-7]。本实验用山姜素体外实验研究观察其对卵巢癌OVCAR-8细胞的增殖和迁移抑制作用，结果提示山姜素具有抗卵巢癌治疗潜能。

首先，CCK-8细胞活力检测结果提示，山姜素在25～400 μmol/L浓度范围内对OVCAR-8细胞的增殖活力均有抑制作用，并呈现明显的剂量和时间依赖效应关系。此外本研究还通过3D肿瘤微球形成实验进一步证实了山姜素对OVCAR-8细胞的增殖活力的抑制作用。除了快速增殖的特性，侵袭迁移也是卵巢癌的恶性习性之一，因此本研究还通过划痕实验来检测山姜素对卵巢癌细胞侵袭迁移能力的作用，结果提示，山姜素可明显抑制OVCAR-8细胞的迁移能力。

线粒体凋亡途径是肿瘤细胞凋亡的重要机制之一，Bcl-2家族成员在肿瘤细胞凋亡中也发挥重要作用。Bax转位入核促进Caspase-9活化进而剪切激活下游的caspase-3，从而导致细胞凋亡，而Bcl-2可抑制Bax的作用[8-14]。本研究发现不同浓度山姜素处理组OVCAR-8细胞后促凋亡蛋白Bax、cleaved-caspase-3和-9表达明显增加，而抗凋亡蛋白Bcl-2表达明显下调，且呈现一定的剂量依赖效应。此外，在肺癌和消化道肿瘤的相关研究中也证实山姜素可促进促凋亡蛋白Bax的表达、抑制抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl的表达[3]，提示山姜素可通过增加Bax/Bcl-2比例，激活以線粒体为中心的信号转导途径而诱导卵巢癌细胞凋亡。

STAT3信号通路肿瘤相关的重要信号通路。磷酸化活化的STAT3转位入细胞核，进而促进包括c-myc、cyclin-D1、Mcl-1、survivin等在内的一系列基因的表达，从而参与卵巢癌发生、增殖、侵袭、耐药和复发[15-20]。本研究为了研究STAT3信号通路在山姜素诱导卵巢癌OVCAR-8细胞增殖和迁移抑制中的作用，结果提示，山姜素可通过抑制STAT3信号通路进而发挥抗卵巢癌作用。此外，肺癌与消化道肿瘤的相关研究表明，PI3K/Akt和Notch信号通路也参与山姜素的抗肿瘤作用[3，6]，因此，我们猜测山姜素可通过对多条信号通路的调控从而发挥其抗肿瘤作用。

综上所述，山姜素是一种具有潜在抗人卵巢癌作用的中药活性成分，可通过抑制STAT3信号通路来抑制卵巢癌细胞的增殖、迁移，并通过线粒体凋亡途径促进卵巢癌细胞的凋亡，为抗卵巢癌新药的研发开辟了新的领域。

[参考文献]

[1] Chien J，Poole E M. Ovarian Cancer Prevention，Screening，and Early Detection [J]. International Journal of Gynecological Cancer，2017，27：S20-S22.

[2] Huo M，Chen N，Chi G，et al. Traditional medicine alpinetin inhibits the inflammatory response in Raw 264.7 cells and mouse models [J]. International Immunopharmacology，2012，12（1）：241-248.

[3] Wu L，Yang W，Zhang SN，et al. Alpinetin inhibits lung cancer progression and elevates sensitization drug-resistant lung cancer cells to cis-diammined dichloridoplatium [J]. Drug Des Devel Ther，2015，9（default）：6119-6127.

[4] Wang Z，Lu W，Li Y，et al. Alpinetin promotes Bax translocation，induces apoptosis through the mitochondrial pathway and arrests human gastric cancer cells at the G2/M phase [J]. Mol Med Rep，2013，7（3）：915-920.

[5] Tang B，Du J，Wang J，et al. Alpinetin suppresses proliferation of human hepatoma cells by the activation of MKK7 and elevates sensitization to cis-diammined dichloridoplatium [J]. Oncology reports，2012，27（4）：1090.

[6] Wang J，Yan Z，Liu X，et al. Alpinetin targets glioma stem cells by suppressing Notch pathway [J]. Tumor Biology，2016，37（7）：9243-9248.

[7] Du J，Tang B，Wang J，et al. Antiproliferative effect of alpinetin in BxPC-3 pancreatic cancer cells [J]. Int J Mol Med，2012，29（4）：607-612.

[8] Estaquier J，Vallette F，Vayssiere JL，et al. The mitochondrial pathways of apoptosis [J]. Adv Exp Med Biol，2012， 942：157-183.

[9] Pokorny J，Jandová A，Nedbalová M，et al. Mitochondrial metabolism - neglected link of cancer transformation and treatment [J]. Prague Med Rep，2012，113（2）：81-94.

[10] Rogalska A，Szula E，Gajek A，et al. Activation of apoptotic pathway in normal，cancer ovarian cells by epothilone B[J]. Environ Toxicol Pharmacol，2013，36（2）：600-610.

[11] Farsinejad S，Gheisary Z，Ebrahimi Samani S，et al. Mitochondrial targeted peptides for cancer therapy [J]. Tumour Biol，2015，36（8）：5715-5725.

[12] Yadav N，Chandra D. Mitochondrial and postmitochondrial survival signaling in cancer [J]. Mitochondrion，2014，16：18-25.

[13] Lopez J，Tait SW. Mitochondrial apoptosis： killing cancer using the enemy within [J]. Br J Cancer，2015，112（6）：957-962.

[14] Ashkenazi A. Targeting the extrinsic apoptotic pathway in cancer： lessons learned and future directions[J]. J Clin Invest，2015，125（2）：487-489.

[15] Chen SH，Murphy DA，Lassoued W，et al. Activated STAT3 is a mediator and biomarker of VEGF endothelial activation [J]. Cancer Biol Ther，2008，7（12）：1994-2003.

[16] Cai L，Zhang G，Tong X，et al. Growth inhibition of human ovarian cancer cells by blocking STAT3 activation with small interfering RNA [J]. European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology，2010， 148（1）：73-80.

[17] Landen CN，Lin YG，Armaiz Pena GN，et al. Neuroendocrine Modulation of Signal Transducer and Activator of Transcription-3 in Ovarian Cancer [J]. Cancer Research，2007，67（21）：10389-10396.

[18] Jia Z，Jia Y，Guo F，et al. Phosphorylation of STAT3 at Tyr705 regulates MMP-9 production in epithelial ovarian cancer [J]. PLoS ONE，2017，12（8）：e183622.

[19] Hirano T，Ishihara K，Hibi M. Roles of STAT3 in mediating the cell growth，differentiation and survival signals relayed through the IL-6 family of cytokine receptors [J]. Oncogene，2000，19（21）：2548-2556.

[20] Siveen KS，Sikka S，Surana R，et al. Targeting the STAT3 signaling pathway in cancer：role of synthetic and natural inhibitors [J]. Biochim Biophys Acta，2014，1845（2）：136-154.