扶正抑瘤汤对肝癌细胞侵袭转移能力影响的研究

彭建新 何军明 蔡炳勤 陈桂豪 刘明

[摘要] 目的 探讨中药扶正抑瘤汤对肝癌细胞侵袭转移能力的影响。 方法 扶正抑瘤汤复合方剂经提取和提纯后处理肝癌细胞，采用MTT法检测肝癌细胞的增殖能力，划痕实验检测肝癌细胞的迁移能力，Transwell实验检测肝癌细胞的侵袭能力。 结果 MTT结果显示，在肝癌细胞HepG2、MHC97-H中，扶正抑瘤汤400 mg/mL组OD值明显低于对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）；划痕实验证明在肝癌细胞MHC97-H中，扶正抑瘤汤400 mg/mL组肝癌细胞迁移速度明显低于对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）；Transwell实验证明，在肝癌细胞MHC97-H中，扶正抑瘤汤400 mg/mL组侵袭的肝癌细胞数量明显低于对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 扶正抑瘤汤能抑制肝癌细胞增殖及侵袭转移能力。

[关键词] 肝癌；扶正抑瘤汤；增殖；侵袭转移

[中图分类号] R273.372 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）04（a）-0025-04

[Abstract] Objective To investigate the effect of Fuzheng Yiliu Decoction on invasion and metastasis of hepatocellular carcinoma cells （HCC）. Methods Hepatocellular carcinoma cells were treated by Fuzheng Yiliu Decoction. MTT assay was used to detect the proliferation of hepatocellular carcinoma cells. The migration ability of HCC cells was detected by scratch test， while the invasion ability of HCC cells was detected by Transwell assay. Results MTT results showed that in HCC lines HepG2， MHC97-H， the proliferation ability of 400 mg/mL Fuzheng Yiliu Decoction group was significantly lower than the control group （P < 0.05）. Scratch test demonstrated that in liver cancer cell MHC97-H， the migration rate of liver cancer cells in Fuzheng Yiliu Decoction 400 mg/mL group was significantly lower than that in the control group （P < 0.05）. Transwell experiment proved that in liver cancer cell MHC97-H， the number of invading hepatoma cells in the 400 mg/mL Fuzheng Yiliu Decoction group was significantly lower than that in the control group （P < 0.05）. Conclusion Fuzheng Yiliu Decoction can inhibit the proliferation， invasion and metastasis of HCC.

[Key words] Hepatocellular carcinoma； Fuzheng Yiliu Decoction； Proliferation； Invasion and metastasis

肝細胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）由于起病隐匿，60%～80%的患者发现时均处于疾病晚期[1]，大量HCC患者因肿瘤转移而丧失手术机会，尽管近年来肝癌的手术切除率已明显提高，然而HCC手术切除5年远处转移率高达80%[2]，局部热消融治疗3年远处转移率高达61%[3-4]，肝移植术后5年远处转移率高达65%[5]。有关HCC的侵袭转移因素及机制的研究是当前的热点。既往研究提示HCC侵袭转移可能与肿瘤血管高密度表达[6]、MAPK通路的激活[7]、细胞基质金属蛋白（MMP）高表达[8]等有关，但具体机制尚未明确，因此探索与HCC侵袭转移相关机制及其治疗意义重大。近年来随着原发性肝癌的中医体质、病因病机、诊断、辨证分型、治疗等研究的迅速发展[9]，中医药在防治肝癌的过程中发挥着日益巨大的作用，中西医结合也成为目前诊治肝癌的最佳途径[10]。扶正抑瘤汤是通过随着扶正培本辩证施治选用的抑气养阴中药，临床中取得一定疗效，但具体机制未明。本实验拟通过体外实验探讨扶正抑瘤法对肝癌细胞的增殖以及侵袭转移能力的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞株和细胞培养

人肝癌细胞株HepG2、MHC97-H购自中科院上海细胞库，采用含有10%胎牛血清的DMEM培养于37℃、5%CO2的培养箱中。

1.2 药物的组成和提取

三棱10 g、莪术15 g、龙葵15 g、白英10 g、半枝莲30 g、白花蛇舌草30 g、黄芪9 g、当归、茯苓 30 g、白术10 g。将中药包按质量1∶15进行水提，水浴锅60℃超声浸泡80 min，共3次。过滤、合并滤液，减压浓缩至浸膏，浸膏得率为33.3%。

1.3 药物处理

以5×106/L的密度分别将HepG2、MHC97-H接种于75 mL细胞培养瓶中，每瓶6 mL。细胞贴壁后，分别加入新鲜配制的扶正抑瘤汤和PBS。为观察肿瘤细胞对药物的剂量依赖性，以终浓度为50、100、200、400 mg/mL的扶正抑瘤汤作用细胞，培养72 h时更换培养液及药物。

1.4 细胞增殖检测

对数生长期细胞，调整细胞密度为103～104个/mL，接种于96孔板中，每孔100 μL，置于CO2培养箱中培养24 h，细胞贴壁后按照分组加入含药培养基，设置4个浓度（50、100、200、400 mg/mL）和对照组（只加培养液），每组设置4个复孔。置培养箱继续培养24、48、72 h后，每孔吸去20 μL上清，加20 μL MTT，在培养箱中温育4 h后，吸净上清，每孔加150 μL DMSO，震荡10 min，用酶标仪在490 nm波长处检测吸光度A值。

1.5 划痕实验

在6孔板背侧横穿过孔均匀划5条横线。将经400 mg/mL扶正抑瘤汤处理96 h后的MHC97-H细胞以5×105个/孔的密度接种6孔板，继续培养12 h使之贴壁，换无血清培养基饥饿12 h。用200 μL枪头垂直皿底横线做划痕，用PBS清洗3遍以弃掉漂浮的细胞。于0、24 h拍照，测量各个时间点细胞迁移距离。每组实验重复3次。

1.6 Transwell实验

经400 mg/mL扶正抑瘤汤处理96 h后的MHC97-H细胞以8×105个/孔种入6孔板中，向铺有Matrigel的Transwell小室上室中加入上细胞悬液，在下室中加入600 μL无血清NIH3T3细胞培养液上清，于37℃、5%CO2孵箱培养48 h。取出Transwell小室用棉签小心擦去上室内层未穿过膜的细胞，以95%乙醇固定20 min，PBS洗涤3次，进行HE染色。在显微镜下观察计数穿过Matrigel和膜的细胞数（40×，镜下10野/室）。对比分析各组细胞的侵袭能力。

1.7 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 扶正抑瘤方对肝癌细胞增殖的影响

结果显示：在肝癌细胞HepG2、MHC97-H中，扶正抑瘤汤400 mg/mL组的OD值明显低于无药物处理的对照组（P < 0.05），提示其对肝癌细胞的增殖有明显抑制作用。见表1。

2.2 扶正抑瘤方对肝癌细胞MHC97-H迁移能力的影响

结果显示，对照组和扶正抑瘤汤400 mg/mL组24 h后划痕宽度差分别为（6.5±1.2）比（17.3±4.4）mm，差异有统计学意义（P < 0.05），提示扶正抑瘤汤对肝癌细胞有迁移能力有明显的抑制作用（图1）。

2.3 扶正抑瘤方對肝癌细胞MHC97-H侵袭能力的影响

结果显示，对照组和扶正抑瘤汤400 mg/mL组穿膜细胞数分别为（135±12）、（53±6）个，差异有统计学意义（P < 0.05），提示扶正抑瘤汤对肝癌细胞侵袭能力有明显的抑制作用（图2）。

3 讨论

肝癌属于中医“积聚”“胁痛”“黄疸”“鼓胀”等疾病范畴，尽管对于肝癌的病因病机各类学说纷呈，但基本达成共识，认为肝癌为本虚标实之证，本虚即脾气不足，正气亏损[11]。标实指邪毒内蕴，气血瘀滞，痰湿蕴结[12]。应用传统的中医药治疗肝癌经验尤为宝贵，各家在治则治法上又有不同，总结起来包括：①以益气健脾的治疗原则。“见肝之病，知肝传脾，当先实脾”为中医之古训，钱伯文认为即使是在热毒壅盛或湿浊内聚而应用清热解毒或化湿利湿等法时，也不忽视扶正的一面[13]。于尔辛则认为肝癌辨证，重在脾胃。②调理气机为主导的治疗方法。肝主疏泄，调人体一身之气机，脾乃中土，为气机升降之枢纽，故治肝癌调理气机为先。于尔辛则强调疏肝与理气的差异，而尤重理气，常用木香、枳实等。刘嘉湘主张肝癌疏通气血、条达为要，不管疾病处于何阶段始终贯彻疏通气血之法，喜用八月札、柴胡、绿萼梅、青皮之类[14]。③消导为主的治疗手段。于尔辛创立了以健脾理气佐以消导的加味四君子汤[15]。

岭南疡科流派代表性传承人名老中医蔡炳勤教授认为：“祛邪为匡正，邪去更扶正”，外科手术、化疗、放疗等方法可谓驱邪的一种手段，而对肿瘤患者的整个治疗过程，必须采用持续性扶正，间断性驱邪。在此指导下，通过多年临床实践，笔者发现肝癌患者多为体虚气弱，久病耗气，外加现代医学常用的手术、化疗、放疗等方法使其精血进一步耗伤，元气受损，常表现为面削形瘦、神疲乏力等正气亏虚之证，同时正虚邪盛，又可导致肿瘤进一步扩散和复发，从而加重病情。因此，针对肝癌患者正气亏虚、气血不足、痰瘀互阻、聚而成瘤的这种虚实夹杂的复杂证候，笔者确立以扶正抑瘤法组方来治疗肝癌[16]。扶正抑瘤汤药物包括“扶正”“抑瘤”两个方面。“扶正”采用能够改善机体内环境、增强免疫功能、提高自身抗肿瘤免疫能力的药物，如黄芪、当归、茯苓、白术，这些药物性味甘平，均有补益气血、健脾扶正、调理脏腑功能的作用。现代医学的研究提示，黄芪中的黄芪总皂苷能明显改善肝癌患者的免疫功能[17]。有研究发现，茯苓中羊毛甾烷三萜类化合物与抗癌药物合用，能促进小鼠巨噬细胞产生集落刺激因子，明显促进粒细胞增殖，引起造血细胞再生，这表明茯苓可提高放、化疗的疗效[18]。“抑瘤”则采用对肿瘤细胞有杀伤作用的中药，如半枝莲、白花蛇舌草、三棱、莪术、龙葵、白英，这些药物性味苦寒，有利湿消肿、清热解毒、软坚散结、抑瘤消癥的功效。有研究报道，以黄芪、当归、莪术、墓头回为主要的扶正抑瘤颗粒含药血清可通过改变小鼠肝癌细胞H22细胞内钙离子浓度诱导细胞发生凋亡[18]。临床上杜建教授以扶正抑瘤法结合中医辨证配伍治疗消化系统肿瘤，可以有效缓解肿瘤术后放化疗的副作用，改善患者的症状，从而提高患者的生存质量[19]。笔者临床工作中亦运用扶正抑瘤的方法对肝癌患者术后进行辩证施治，该方对预防肝癌患者术后复发转移取得了满意的临床疗效，但以现代医学的方法探讨扶正抑瘤汤对肝癌的侵袭转移具体机制还有待进一步研究。

侵袭、转移性是肝癌恶性生物学行为的重要特征，虽然手术治疗仍是目前提高肝癌治疗效果的主要手段，然而仅少数较早期肝癌患者适合手术治疗，大部分患者因肿瘤的转移而丧失了手术机会。即使接受手术治疗，术后发生转移及复发的概率也非常高，5年无瘤生存率仅26%左右[20]。大多数肝癌患者并非死于原发性癌而是死于转移性癌。因此，探索能够抑制肝癌侵袭、转移的治疗方法有重要意义。在前期临床使用扶正抑瘤汤对肝癌患者术后治疗有一定临床效果的基础上，本研究先通过MTT检测扶正抑瘤汤处理后肝癌细胞增殖能力的变化，结果发现扶正抑瘤汤处理组肝癌细胞的OD值较对照组有明显差别，且OD值与药物的浓度之间有一定的负相关性，提示扶正抑瘤汤能明显抑制肝癌细胞的增殖能力。进一步采用划痕实验和Transwell实验发现扶正抑瘤汤处理后肝癌细胞MHC97-H的迁移能力和侵袭能力较对照组均明显降低，表明扶正抑瘤汤对肝癌细胞的侵袭迁移能力有一定的抑制作用。

综上所述，以“扶正培本、抑瘤散结”为治法的扶正抑瘤汤能够抑制肝癌细胞的增殖，进一步的研究发现其能抑制肝癌细胞的侵袭转移能力。虽然其具体机制尚未明确，但为扶正抑瘤方有效降低临床肝癌患者术后的复发和转移提供了理论依据，也为临床合理的用药提供了科学依据。

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