闾红燕 黄绳武
[摘要] 目的 建立冻干蟾皮凝胶剂质量标准和初步药效学研究。方法 采用薄层色谱(TLC)法对制剂中的华蟾酥毒基和酯蟾毒配基进行定性鉴别,高效液相色谱(HPLC)法测定华蟾酥毒基和酯蟾毒配基含量,色谱柱kromasil C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相:乙腈(A)-水(B)(48︰52);流速:1 mL/min;检测波长:296 nm;柱温:30℃;进样量:10 μL。采用S180腹水型实体瘤小鼠进行初步抑瘤药效学研究。结果 硅胶G薄层板上,在与对照品色谱对应的位置上,显示相同颜色的荧光斑点,且斑点大小适中,分离度良好。华蟾酥毒基和酯蟾毒配基分别在0.056~4.48 μg/mL,0.256~10.24 μg/mL范围内,峰面积与浓度存在良好的线性关系(r=0.9987、0.9996)。加样回收率(n=6)为100.27%、101.68%,相对标准偏差为1.56%、1.67%。初步药效学结果显示冻干蟾皮凝胶剂不同剂量组均有显著抗肿瘤作用,且高剂量组效果最佳,抑瘤率为48.03%。结论 建立了冻干蟾皮凝胶剂质量标准,初步药效学表明冻干蟾皮凝胶剂具有显著抗肿瘤作用。
[关键词] 冻干蟾皮凝胶剂;质量標准;抗肿瘤;华蟾酥毒基;酯蟾毒配基
[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210(2018)04(a)-0029-05
[Abstract] Objective To establish the quality standard and preliminary pharmacodynamic study of Freeze-dried Toad Skin Gel. Methods TLC was used for the qualitative identification of Cinobufagin and Resibufogenin, HPLC was adopted to determine content of Cinobufagin and Resibufogenin. Chromatographic column: kromasil C18 (4.6 mm×250 mm, 5 μm); flowing phase: acetonitrile (A)- water (B) (48∶52); flow rate: 1 mL/min; UV detection wavelength: 296 nm; column temperature: 30℃; the volume: 10 μL. S180 ascites solid tumor mice were used to study the pharmacodynamics of inhibition of tumor growth. Results The fluorescence spots of the same color were shown in the corresponding position of the Silica gel G thin layer, and the spot size was moderate and the separation degree was good. Cinobufagin and Resibufogenin showed good linearity between the peak area and the concentration in the range of 0.056-4.48 μg/mL (r=0.9987) and 0.256-10.24 μg/mL (0.9996), respectively. The sample recovery rate(n=6) was 100.27%, 101.68%, RSD was 1.56% and 1.67%. The Preliminary pharmacodynamics study showed that all groups of Freeze-dried Toad Skin Gel had significant anti-tumor effect, and the high-dose group had the best effect, with the inhibitory rate of 48.03%. Conclusion The quality standard of Freeze-dried Toad Skin Gel is established, and the preliminary pharmacodynamics shows that it has a significant anti-tumor effect.
[Key words] Freeze-dried Toad Skin Gel; Quality standard; Anti-tumor; Cinobufagin; Resibufogenin
蟾皮(Corium bofonis),又称蛤蚆皮(《医方约说》),癞蟆皮(《中药材手册》),蟾蜍皮、蛤蟆皮(《中草药学》),为蟾蜍科动物中华大蟾蜍(Bufo bufogargarizans Cantor)或黑眶蟾蜍(Bufo melanostictus Schneider)的干燥皮,自古至今沿用,其性味辛、凉、微毒,主入胃经,具有清热解毒,利水消胀的功效,近年来,用于多种癌症的治疗和配合放、化疗,不仅能够有效抑制癌细胞的过度增殖,还具有改善血象,减轻放、化疗毒副作用的功效[1-3]。冻干蟾皮凝胶剂为鲜蟾皮低温冷冻干燥后采用超微粉碎技术[4],并辅以高分子材料为基质制成的外用凝胶剂[5-7],该剂型剂量可控,透皮吸收迅速[8-9],药物吸收干扰因素小,避免药物的肝脏首过作用[10-11],血药浓度稳定,能够有效提高药物生物利用度,并可反复敷贴,随时停药,使用方便,对皮肤无刺激性和致敏性[12-14]。
制订中药制剂的质量标准是制剂制备的最终目标,控制制剂的质量,以保证临床试验药品和上市药品的质量有效和安全。本文参照《中国药典》2015年版(四部)附录通则0114凝胶剂相关检查项,包括外观性状、pH值检查、薄层鉴别、含量测定等,以确保药品安全、有效。
1 仪器与试药
1.1 仪器
天美公司LC2000梯度系统;LC2130输液泵(日本原装进口),配梯度洗脱和在线脱气装置;LC2030紫外检测器;手动进样器7725i;色谱工作站T2000P;AB104-N电子分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)数控超声波清洗器(KQ5200DE,昆山市超声仪器有限公司);电子天平(FA2004,常州市幸运电子设备有限公司);智能透皮试验仪(YB-P6,天津药典标准仪器厂制造);数显恒温水浴锅(HH-4,常州澳华仪器有限公司)。
1.2 药品和试剂
冻干蟾皮凝胶剂(实验室自制);对照品酯蟾毒配基(中国食品药品检定研究院提供,批号:110718-200507),对照品华蟾酥毒基(中国食品药品检定研究院提供,批号:110803-200605);环磷酰胺(江苏恒瑞医药股份有限公司,批号:11072821);環己烷(上海强顺化学试剂有限公司,批号:20151101);三氯甲烷(衢州巨化试剂有限公司,批号:20150501);丙酮(浙江杭州大方化学试剂厂,批号:20140926);生理盐水(中国广州百特医疗用品有限公司生产,批号:GS1105064);甲醇、乙醇、乙腈均为色谱纯,其他试剂均为分析纯,水为超纯水。
1.3 动物
小鼠S180腹水型肿瘤细胞和细胞株(由浙江省医科院提供);健康美国癌症研究所(Institute of Cancer Research,ICR)小鼠,雌雄各半,SPF级,年龄4~6周,体重18~22 g。购于上海实验动物中心,饲养于浙江中医药大学中药资源与鉴定教研室实验动物中心,饲养环境:室温为(22 ± 2)℃,湿度为(50 ± 10)%。
2 方法与结果
2.1 理化性质考察
2.1.1 性状 本品为深灰色半固体,质地均匀,细腻,黏度适宜,涂展性好,气微腥。
2.1.2 酸碱度 人体皮肤表面呈偏酸性,其pH值介于5.5~7.0之间,皮脂具有中和酸碱的能力,对酸性和碱性物质有缓冲作用[6],取冻干蟾皮凝胶剂1 g,加入20 mL蒸馏水,超声30 min,使其完全分散,室温下放置30 min,取上清液测pH,测得其平均pH值为6.7。
2.1.3 鉴别 精密称取华蟾酥毒基1.4 mg和酯蟾毒配基1.1 mg,甲醇定容至10 mL,配制成混合对照品。精密取3批冻干蟾皮凝胶剂和空白凝胶剂各1 g,加甲醇10 mL,称重,分散,回流1 h,放冷,补足失重,过滤,取滤液。参照《中国药典》2015年版(四部)通则0502薄层色谱法试验,吸取上述溶液各10 μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以环己烷-三氯甲烷-丙酮(4∶3∶3)为展开剂展开,取出,晾干后喷以10%硫酸乙醇溶液显色,待溶液挥干后,置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中,在与对照品色谱对应的位置上,显示相同颜色的荧光斑点,且斑点大小适中,分离度良好(图1)。外用制剂对黏度有一定的要求,应用黏度计测定冻干蟾皮凝胶剂的黏度。按《中国药典》2015年版(四部)通则0633黏度测定法第三法,室温下用旋转黏度计测定3批凝胶剂平均黏度为29.03 Pa·s。
2.2 含量测定
2.2.1 色谱条件 高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)色谱柱:kromasil C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)(瑞典);流动相:乙腈(A)-水(B)(48∶52);流速:1 mL/min;检测波长:296 nm;柱温:30℃;进样量:10 μL[15-17]。
2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取华蟾素毒基1.4 mg,酯蟾毒配基3.2 mg置于10 mL容量瓶中,甲醇定容,作为对照品储备液。
2.2.3 供试品溶液的制备 分别精密称取3批冻干蟾皮凝胶剂0.4 g,加入甲醇20 mL,称定重量,加热回流提取60 min,室温冷却,甲醇补足失重,过滤,取滤液,过膜,作为供试品储备液。
2.2.4 最大波长的选择 精密称取华蟾酥毒基和酯蟾毒配基对照品适量,用甲醇配制成对照品溶液,以甲醇为空白,分别在200~500 nm波长范围内进行扫描,结果对照品溶液在296 nm波长附近有最大吸收,故选择测定波长为296 nm。
2.2.5 专属性考察 精密移取对照品储备液1 mL置于25 mL容量瓶中,甲醇定容,精密移取3.5 mL置于10 mL容量瓶中,作为稀释后对照品溶液;取“2.2.3”项下供试品溶液;取溶剂甲醇进样,每次进样10 μL,按上述色谱条件测定。结果显示,在此色谱条件下,溶剂不干扰主药的测定(图2)。
2.2.6 标准曲线的绘制 取上述对照品储备液1.0 mL置于25 mL容量瓶中,甲醇定容,精密移取0.1、0.5、2.0、3.5、5.0、6.5、8.0 mL置于10 mL容量瓶中,过膜,进样10 μL。以样品浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,华蟾酥毒基线性回归方程Y=4714.3964X-253.3696,r=0.9987,酯蟾毒配基线性回归方程Y=33 255.0527X-28.2238,r=0.9996,可见华蟾酥毒基和酯蟾毒配基分别在0.056~4.48、0.256~10.24 μg/mL范围内,峰面积与浓度存在良好的线性关系。
2.2.7精密度试验 精密移取上述对照品储备液1 mL置于25 mL容量瓶中,甲醇定容,精密移取3.5 mL置于10 mL容量瓶中,过膜,进样10 μL。结果显示,华蟾酥毒基和酯蟾毒配基相对峰面积相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)均小于2%(表1),表明仪器的精密度良好。
2.2.8 重复性试验 精密平行称取同一批冻干蟾皮凝胶剂6份,按照“2.2.3”项下供试品制备方法制备,所得样品按以上色谱条件连续平行进样6次,分别测定华蟾酥毒基和酯蟾毒配基含量。结果显示,华蟾酥毒基和酯蟾毒配基濃度RSD均小于3%(表2),表明该方法重现性良好。
2.2.9 稳定性试验 精密称取冻干产品凝胶剂0.4 g,按照“2.2.3”供试品处理方法制备供试品溶液。分别于0、2、4、8、16、24 h时注入液相色谱仪,测定供试品溶液中华蟾酥毒基和酯蟾毒配基含量,考察其稳定性。结果显示:华蟾酥毒基和酯蟾毒配基浓度RSD均小于2%(表3),表明供试品溶液在24 h内稳定。
2.2.10 回收率试验 精密称取对照品华蟾酥毒基和酯蟾毒配基适量,加入到已知浓度两者含量的供试品中,在以上色谱条件下,测定两者含量,计算加样回收率。结果显示,华蟾酥毒基和酯蟾毒配基平均回收率分别为100.27%、101.68%,RSD均小于2%(表4、5),表明该方法准确性良好。
2.2.11 含量测定方法 分别取批号20170322、20170327和20170411共3批冻干蟾皮凝胶剂,按照“2.2.3”项下的供试品制备方法处理,平行制备6份供试品溶液。按照“2.2.1”项下的色谱条件进样10 μL,测定峰面积。测得样品中华蟾酥毒基分别为208.77、199.74、207.32 μg/g;酯蟾毒配基分别为192.22、181.87、186.63 μg/g。结果表明,即每l克凝胶所含华蟾酥毒基和酯蟾毒配基含量分别不得低于190 μg和180 μg,两者总量不低于370 μg。
2.3 初步药效学研究
2.3.1 S180荷瘤小鼠模型建立 自液氮罐中取出S180腹水型肿瘤细胞株1支,置于37℃电热恒温水浴锅内,轻轻摇动使其缓慢融化,取出冻存管,用酒精消毒后备用,吸出细胞悬液,注入离心管并滴加15%胎牛血清RPMI-1640培养基,制成肿瘤细胞混悬液,台盼蓝计数约为1×107/mL瘤细胞。消毒小鼠背臀部,取0.2 mL(1×106~2×106个瘤细胞)接种于皮下,传代3次[11-12]。选择接种8 d的S180荷瘤小鼠,脱颈处死,抽取小鼠腹腔内腹水,用生理盐水适当稀释后,计数,调整浓度至2×107,用无菌注射器吸取瘤细胞混悬液注射在小鼠背臀部,每只0.2 mL,4~6 d后背臀部测量肿瘤体积均达50~80 mm3。
2.3.2 实验分组和给药 接种瘤细胞后的ICR小鼠60只,称重记录体重,按体重和性别随机分为6组,分别为冻干蟾皮凝胶剂高剂量组4 g/kg(蟾皮高剂量组)、冻干蟾皮凝胶剂中剂量组2 g/kg(蟾皮中剂量组)、冻干蟾皮凝胶剂低剂量组1 g/kg(蟾皮低剂量组)、蟾酥凝胶剂中剂量组0.054 g/kg(蟾酥中剂量组)、空白凝胶剂组(阴性组)、环磷酰胺组0.5 mg/20 g(阳性组),每组10只,每只均单笼饲养。饲养环境:室温为(22 ± 2)℃,湿度为(50 ± 10)%。所有小鼠均于12 h光照和12 h黑暗环境下适应性饲养数天,自由饮食饮水。给药之前禁食12 h,全程不禁水。
2.3.3 数据收集 除阳性组腹腔注射外,其余组别均采用背臀部涂抹给药连续20 d,观察记录小鼠的一般情况(外观、毛色、饮食、行为、分泌物、排泄物、中毒表现和死亡情况等),每日称荷瘤小鼠重量,停药后第2天记录体重,处死后解剖,剥取肿瘤组织、脾脏、胸腺,电子天平精密称重。
2.3.4 检测指标 抑瘤率(%)=(1-实验组平均瘤重/阴性对照组平均瘤重)×100%;脾指数=脾重量(mg)/体重(g);胸腺指数=胸腺重量(mg)/体重(g)。
2.4 统计学方法
采用SPSS 16.0版统计软件进行数据处理,计量资料数据以均数±标准差(x±s)表示,多组数据间比较采用方差分析,两两比较采用LSD-t检验。计数资料以率表示,采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义
2.5 实验结果
在观察期间小鼠的一般情况总体良好,由于肿瘤接种于小鼠背臀部,该部位血管分布较少,导致肿瘤生长相对缓慢,对小鼠活动能力无显著影响,实验过程中无小鼠死亡。在接种后5~7 d,肉眼可见实体瘤生成,各组小鼠给药后的抑瘤率情况比较,所有给药组均与阴性组比较,差异有统计学意义(P < 0.05),同时蟾皮中剂量组和蟾酥中剂量组比较,差异无统计学意义(P > 0.05)。见表6。
3 讨论
本品性状为深灰色半固体,pH值介于5~7之间,与人体皮肤值相近,有利于延长药物在皮肤表面的滞留时间。在定性定量测定中,均采以甲醇为溶剂将凝胶剂溶解分散后加热回流,过膜、测定,使主药尽可能溶出,同时可去除辅料的干扰。薄层色谱鉴别参照《中国药典》2015年版(四部)通则0502薄层色谱法试验华蟾酥毒基和酯蟾毒配基采用环己烷-三氯甲烷-丙酮(4∶3∶3)展开,10%硫酸乙醇溶液显色,紫外365 nm处分别显示黄色和蓝紫色荧光,阴性无干扰。采用HPLC测定制剂中华蟾酥毒基和酯蟾毒配基含量,色谱条件为色谱柱:kromasil C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)(瑞典);流动相:乙腈(A)-水(B)(48︰52);流速:1 mL/min;柱温:30℃;检测波长:296 nm。在上述实验条件下,测得冻干蟾皮凝胶剂中华蟾酥毒基和酯蟾毒配基总量不低于380 μg/g,该测定方法简便易行,精密度、重现性良好。
蟾酥中以华蟾酥毒基和酯蟾毒配基为代表的脂溶性成分,具有较强的抗肿瘤活性,本课题采用蟾皮和蟾酥分别制成凝胶剂给药后,发现在相同含量的有效成分下,两者对肿瘤的抑制率不存在显著性差异。腹腔注射阳性药环磷酰胺抑瘤率较差,可能原因为本课题采用背部皮下接种,腹腔注射为全身作用,对于局部治疗效果较差。脾脏和胸腺是机体重要的免疫器官,二者对细胞毒药物敏感性较高,在化疗药物作用下明显萎缩,其组织结构发生器质性损伤,是评价药物疗效的重要免疫指标。
本实验由于条件限制未对凝胶剂微生物限定和皮肤刺激性进行研究,课题组将继续完善制剂的相关研究,同时仅完成初步药效学研究,后续将进行细胞水平和整体水平完整的药效学研究,为后续的新药研发奠定基础。
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