DABS-Cl柱前衍生-HPLC法测定豆豉中的γ-氨基丁酸含量

丁素君，何新蕾

(漯河医学高等专科学校化学教研室，河南 漯河 462002)

γ-氨基丁酸 (γ-aminobutyric acid，GABA) 为天然氨基酸，为重要的抑制性神经递质，具有降血压、镇静和改善脑、肝、肾等生理功能。而GABA可通过微生物提供的谷氨酸脱羧酶对谷氨酸进行脱羧产生[1]。而传统发酵豆豉含有丰富的谷氨酸，通过微生物发酵可获得足够量的 GABA，但由于工艺不同，差异也挺大，因此了解不同豆豉中的GABA含量是必要的[2]。目前，GABA的测定方法较多，包括比色法、电泳法、气相色谱法以及液相色谱法，其中由于GABA对电化学和紫外-可见光灵敏度低，HPLC需要进行柱前衍生[3]。而柱前衍生剂有异硫氰酸苯酯(PITC)、邻苯二甲醛(OPA)-巯基乙醇、6-氨基喹啉基-N-羟基-琥珀酰亚胺基甲酸酯(AQC)等，其中OPA衍生产物不稳定，且自身带有一定的刺激性气味，AQC水解后产物易产生干扰峰[4]。本实验重点分析采用磺酰氯二甲胺偶氮苯(DABS-Cl)作为柱前衍生剂，采用HPLC快速、准确测定豆豉中γ-氨基丁酸水平。

1 实验部分

1.1 仪器与设备

柱(4.6 mm×250 mm，5 μm) Waters公司；TGL-16C 台式离心机 上海安亭科学仪器厂；Sartorius Bp211D 电子天平 德国Sartorius。

1.2 试剂与材料

γ-氨基丁酸标准品：购自美国Sigma公司；磺酰氯二甲胺偶氮苯：购自Supecol公司；甲醇、乙腈均为HPLC级；水为超纯水。

1.3 实验方法

1.3.1 样品预处理

重庆永川豆豉冷冻干燥、粉碎，过40目，精确称取 0.5 g 冻干粉，加入20.0 mL 10%的三氯乙酸，涡旋2 min，45 ℃水浴中超声辅助提取2 h，3000 r/min离心10 min，取上清， 0.45 μm纤维素膜过滤，备用。

1.3.2 衍生条件

精密量取样品液100 μL，冷冻干燥，0.1 mol/L碳酸盐体系(pH为9.0)复溶，4 mmol/L 的DABS-Cl衍生剂溶液(DABS-Cl 129.5 mg、乙腈10 mL)100 μL，混匀，70 ℃恒温水浴中反应20 min，加300 μL终止液(150 μL 40 mmol/L磷酸盐缓冲液，pH为6.5，150 μL无水乙醇)，混匀，3000 r/min 离心10 min，取上清,0.45 μm滤膜过滤，20 μL进样。

1.3.3 色谱条件

695型液相色谱仪带二极管阵列检测器；默克RP C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相A：(乙腈∶甲醇为75∶25)流动相B：(0.04 mmol/L 醋酸钠，pH为7.3) ；柱温：35 ℃；进样体积20 μL；流速：0.8 mL/min；检测波长：430 nm；洗脱条件：0～10 min，75%A；10～25 min，60%A；25～26 min，45%A；26～30 min，25%A。

2 结果与分析

2.1 检测波长的确定

图1 γ-氨基丁酸波长扫描图

由图1可知，γ-氨基丁酸衍生后在300～450 nm的吸收光谱，其中430 nm处吸收峰较高，故选择430 nm为检测波长。

2.2 分离效果

本色谱条件能将γ-氨基丁酸与其他氨基酸做到基线分离，干扰小，见图2。

图2 γ-氨基丁酸色谱图

2.3 衍生条件的优化

考察了不同的pH、温度和衍生时间对γ-氨基丁酸测定的影响。结果显示：pH为9.0，70 ℃反应20 min后，峰面积最大，见表1～表3。

表1 pH对γ-氨基丁酸衍生的影响

表2 温度对γ-氨基丁酸衍生的影响

表3 衍生反应时间对γ-氨基丁酸衍生的影响

2.4 标准曲线和重复性

0.1 mol/L pH 9.0碳酸盐体系配制浓度分别为24.00，12.00，6.00，3.00，1.50 μg/mL的GABA对照品溶液和4 mmol/L的DABS-Cl衍生剂溶液，于70 ℃反应20 min，加入300 μL衍生反应终止液，进样测定峰面积，以γ-氨基丁酸为横坐标，峰面积为纵坐标制作标准曲线。得γ-氨基丁酸线性方程为：Y=2.48063X×105+1.52957×105(r=0.9997)，可见γ-氨基丁酸在(1.50～24.00 μg/mL)浓度范围内线性关系良好。

精密吸取样品溶液6份，每份100 μL，参照1.3.2制备衍生溶液，进样，记录峰面积，测定γ-氨基丁酸的含量，结果显示：γ-氨基丁酸的平均含量为16.22 μg/mL，RSD值为3.17%，表明方法重复性良好。

2.5 精密度试验

精密吸取衍生后同期重庆永川豆豉样品溶液20 μL，连续进样6次，结果γ-氨基丁酸峰面积RSD值为1.51%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

精密吸取衍生后同期重庆永川豆豉样品溶液20 μL分别在0，4，8，12，24 h进样，测定峰面积，结果峰面积的RSD值为1.12%，表明衍生后样品溶液在24 h内基本稳定。

2.7 加样回收率试验

精密称取已知含量的同期重庆永川豆豉样品0.25 g冻干粉，平行试验9份，分别加入γ-氨基丁酸适量，按1.3.1和 1.3.2制备样品后，进样测定峰面积，并计算加样回收率，见表4。γ-氨基丁酸平均加样回收率为100.83%，RSD值为2.25%，结果表明加样回收率试验良好。

表4 γ-氨基丁酸加样回收率试验

续 表

2.8 实际样品的检测

对市售5类豆豉中的 GABA 含量进行了测定，陕西商洛豆豉255.4 mg/kg，四川黄豆豆豉147.5 mg/kg，广东阳江豆豉551.4 mg/kg，重庆永川豆豉648.9 mg/kg，湖北豆豉1461.0 mg/kg。

3 结论

本研究建立了DABS-Cl柱前衍生-HPLC测定豆豉中γ-氨基丁酸的方法，该方法检测结果不会受到氨基酸DABS-Cl衍生物的影响，并且能做到γ-氨基丁酸与其他氨基酸基线分离，干扰小，适用性更强，准确、可靠，可用于对该类豆制品物质的测定。

参考文献：

[1]杨曦,刘玉洁,马慧娟，等.γ-氨基丁酸与糖尿病[J].国际内分泌代谢杂志,2017,37(1):45-47.

[2]马艳莉,卢忆,张晓阳，等.腐乳发酵过程中γ-氨基丁酸变化规律研究[J].中国食物与营养,2013,19(5):27-30.

[3]赵燕燕,王艳,刘丽艳，等.化学物质衍生-同步荧光法测定注射液中γ-氨基丁酸的含量[J].河北大学学报(自然科学版),2013,33(1):35-41,52.

[4]涂云飞,杨秀芳,张士康，等.柱前衍生高效液相色谱法测定茶叶中茶氨酸及y-氨基丁酸[J].色谱,2012,30(2):184-189.