Krüppel样因子6对于TGF-β1诱导的晶状体上皮细胞纤维化的调控作用研究

高美子 ，黄亮瑜 ，东莉洁 ，杨光 ，田芳

后发性白内障是白内障囊外摘除术后常见并发症，是由术后残留的晶状体细胞增殖移行和上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）等引起的晶状体后囊膜混浊后囊膜混浊（posterior capsular opacification,PCO）[1]，是白内障术后视力下降的常见原因。近年来手术方案和人工晶状体虽有改良，PCO的防止也随之取得一些进展，但关于其发病机制尚不明确。转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）是一种能使正常的成纤维细胞的表型发生转化，主要参与调节细胞的生长与分化的生长因子，在房水、玻璃体、晶状体上皮细胞中均有表达，对晶状体上皮细胞（lens epithelial cells,LECs）终末分化具有调节作用[2]。 TGF-β1通路也是参与和诱导EMT的重要途径，是目前已知的参与诱导LECs发生EMT的重要细胞因子[3]。

Krüppel样因子 6（Krüppel-like factor6,KLF6）是一种肿瘤抑制因子，多项研究证实[4]其在细胞发育、细胞分化、增生、凋亡、血管生成及组织修复等生理或病理过程中发挥重要作用，并在多种纤维化疾病机制的研究中发现KLF6与TGF-β1的表达，具有相关性和潜在联系[5-7]。

鉴于KLF6在细胞纤维化中的重要作用，以及TGF-β1在晶状体上皮细胞EMT过程中的调控作用。本次研究采用真核质粒转染法，初步探讨KLF6过表达对TGF-β1诱导的晶状体上皮细胞纤维化的影响，从而为进一步探讨后发障的发病机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

人晶状体上皮细胞 （human lensepithelial cells,HLECs）细胞株（HLE-B3细胞）（由天津医科大学眼科学院眼科研究所杨春波博士惠赠），pEGFP-C2-KLF6真核表达质粒由本实验室自行构建，其制备的方法及有效性验证等实验内容已发表于《中华实验眼科杂志》，转染pSilencer-KLF6由本实验室自行构建，TGF-β1购自美国peprotech（工作浓度0.5 ng/ml），Trizol试剂 （美国 Invitrogen公司），First Strand cDNA Synthesis Kit（美国 Thermo 公司），2xSYBRGreen Mix （瑞士 Roche 公司），DreamTaqTMHot Start DNA Polymerase，Transwell小 室 （ 美 国Coming公司），Lipofeetamine 2000 （美国 Invitrogen公司）。

1.2 细胞培养

使用含有10%FBS、100 U/ml青霉素和100 U/ml链霉素的RPMI-1640完全培养基，置于37℃，95%空气，5%二氧化碳的密闭恒温培养箱中培养。

1.3 转染与检测

检测 pEGFP-C2-KLF6（KLF6）和 pSilencer-KLF6（siKLF6）转染后HLECs中KLF6表达情况。接种每孔6×105个HLECs于1 ml培养体系的6孔细胞培养板中，待细胞汇合度达到70%左右，利用脂质体2000分别转染空载体、KLF6和siKLF6至HLECs中。转染48 h后，提取总RNA经反转录聚合酶链反应 （reverse transcriotion-polymerase chain reaction,RT-PCR）及实时定量PCR反应（real-time quantitative PCR,q-PCR）的方法分析KLF6的表达。

1.4 两种PCR方法分析转录水平的基因表达

体外培养HLECs细胞：接种于6孔板，按实验分组予相应的处理，37℃，5%CO2培养48 h后，进行总RNA提取。

按Trizol提取液说明书抽提细胞总RNA：首先4℃预冷离心机，同时新鲜配置体积分数75%乙醇溶液置于4℃备用。吸弃6孔板中的培基，用PBS洗2次，每次3 min，每个孔加入 1 ml的 Trizol，静置 3～5 min，将细胞裂解液吸到1.5ml EP管中，加200μl氯仿轻摇15 s，待溶液混合成粉红色，静置15 min，4℃，Frc=12 000离心15 min，取上清至另一新EP管中，加入等量异丙醇，吹打混匀上下倒置数次，静置10 min，4℃，Frc=12 000离心 15 min，弃上清，加入 1 ml已配好的体积分数75%乙醇，4℃，Frc=12 000离心5 min，弃上清后晾干，加入40μl DEPC水溶解并静置20 min，涡旋后离心，超微量分光光度计检测其浓度，A260/A280比值介于 1.8～2.0之间视为RNA提取质量良好，存于-80℃保存备用。

cDNA反转录：根据测得的RNA浓度，来计算1 μg RNA所对应的体积，加入到提前置于冰上的无菌无核酸酶的PCR管中，并按照顺序依次加入下面的反应物，建立一个总量为12μl的体系，其中oligo（dT）加1μl，RNA为所算好的体积，最后用DEPC补足到12μl，放入RNA逆转装置65℃孵育5 min，冰上冷却，离心收集，再置于冰上冷却，依次加入4 μl reaction buffer，1 μl RNase inhibitor，1 μl transcriptase和 2μl dNTP 2μl，总体积为 20μl，轻轻混匀后离心，42℃孵育60 min，70℃加热5 min终止反应，反应物可直接用于PCR反应。甘油醛-3-磷酸脱氢 酶 （glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）为内参。

RT-PCR：引物选择见表1，反应条件见表2，最后所得扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离，于紫外透射仪下观察结果。

表1 RT-PCR引物

表2 RT-PCR反应条件

q-PCR：引物选择见表3。将2μl模板cDNA，2 μl上下游引物的等比混合物，4μl SYBR荧光染料，最终体积8μl，依次加入384孔板（避光冰上操作），每组3个复孔，实验重复3次，放入Real-time PCR仪内反应，调整扩增参数为：50℃2 min孵育，95℃10 min变性，重复40次循环：95℃15 s变性、55℃30 s退火、72℃30 s延伸；最后加入解离阶段（95℃15 s、60 ℃ 15 s、95 ℃ 15 s）。根据扩增曲线，输出 CT值，依照公式 2-ΔΔCt法进行数据分析。

表3 q-PCR引物

1.5 Transwell细胞迁移实验

体外培养HLECs细胞，并分为3组：空载体对照组（只转染空载体，无KLF6质粒，无TGF-β1刺激），单纯 TGF-β1刺激组 （转染空载体并予以TGF-β1刺激），KLF6高表达组 （转染KLF6质粒并予以 TGF-β1）

接种于6孔板，按实验分组予相应的处理，37℃，5%CO2培养 48 h后，取出 transwell板，先用1640培养液浸润，下层加入600μl，上层加入100 μl，放在37℃培养箱中孵育1 h，在孵育1 h期间，用胰酶消化3组细胞，离心、计数各组细胞，用1%培养基将细胞配制成浓度为3×105/ml，每组设3个复孔，取出transwell板，弃除之前小室上1640培养液，入配制好的细胞悬浮液100μl，轻晃transwell板，放于培养箱中。提前配制好吉姆萨染液，以1 g的姬姆色素染料加入66 ml甘油，混匀，60℃保温溶解2 h，再加入66 ml甲醇混匀，即配成姬姆色素原液，此原液用前用PBS稀释10倍左右就可以使用 （此为姬姆萨工作液）。根据需要量，配好工作液，此工作液常温可保存2周。用真空泵小心吸取下室上清液和上室培养液，再用棉签轻微擦拭小室基膜，以擦除基膜内壁细胞，然后在下室加入600μl 0.1%吉姆萨染液，染色25 min，用18.2Ω水清洗3遍，每次10 min，清洗完成后适度风干，用角膜刀将基膜环形切下，注意正反面，小室底面在上，放置在载玻片上，用玻璃棒蘸取中性树胶一滴于基膜上，将盖玻片从一侧缓慢放于基膜上（尽量不产生气泡）。

在光学显微镜下观察基膜上的细胞，并分4个象限随机视野下拍照，每个象限2张，采用直接计数法计数穿过基膜细胞数。重复试验3次，统计数据，进行分析。

1.6 统计学方法

使用SPSS 18.0统计软件进行统计学分析，GraphPad Prism7软件对所获得数据进行图表整理。计量资料组间比较采用两独立样本t检验 （2组数据）或单因素方差分析（3组数据）。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 pEGFP-C2-KLF6转染后HLECs中KLF6表达水平

RT-PCR琼脂糖凝胶电泳显示，KLF6组中的亮度高于空载体对照组（Vec组）（图1A）；灰度分析结果显示，KLF6组中KLF6表达水平显著高于Vec组，且差异具有统计学意义（P＜0.05）（图 1B）。q-PCR显示，KLF6组中的KLF6表达量显著高于Vec组（图 1C）。说明 pEGFP-C2-KLF6转染可以提高HLECs中KLF6的表达水平。

2.2 pSilencer-KLF6转染后HLECs中KLF6表达水平

RT-PCR琼脂糖凝胶电泳显示，siKLF6组中KLF6的亮度低于Vec组（图2A）；灰度分析结果显示，siKLF6组中KLF6表达水平显著低于Vec组中KLF6表达水平，且差异具有统计学意义 （P＜0.05）（图2B）。q-PCR显示，siKLF6组中KLF6的表达量显著低于Vec组（图2C）。说明pSilencer-KLF6转染可以降低HLECs中KLF6的表达水平。

图1 pEGFP-C2-KLF6转染后HLECs中KLF6表达情况及定量分析。1A.琼脂糖凝胶电泳显示pEGFP-C2-KLF6转染后HLECs中KLF6表达情况（RT-PCR）；1B.琼脂糖凝胶电泳的灰度分析结果；1C.pEGFP-C2-KLF6转染后 HLECs中 KLF6表达情况 （q-PCR） Vec： 空载体对照组 KLF6：pEGFP-C2-KLF6转染组 HLECs：人晶状体上皮细胞 GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶

图2 pSilencer-KLF6转染后HLECs中KLF6表达情况及定量分析。2A.琼脂糖凝胶电泳显示pSilencer-KLF6转染后HLECs中KLF6表达情况 （RT-PCR）；2B.琼脂糖凝胶电泳的灰度分析结果；2C.pSilencer-KLF6转染后HLECs中KLF6表达情况（q-PCR） Vec：空载体对照组 siKLF6：pSilencer-KLF6转染组 HLECs：人晶状体上皮细胞 GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶

2.3 pEGFP-C2-KLF6转染后 HLECs中E-cadherin表达水平

RT-PCR琼脂糖凝胶电泳显示，KLF6组中E-cadherin的亮度低于Vec组（图3A）；灰度分析结果显示，KLF6组中E-cadherin表达水平显著低于Vec组中E-cadherin表达水平，且差异具有统计学意义 （P＜0.05）（图 3B）。q-PCR 显示，KLF6 组中E-cadherin的表达量显著低于Vec组（图3C）。说明pEGFP-C2-KLF6转染致KLF6高表达后，HLECs中E-cadherin的表达降低。

2.4 pEGFP-C2-KLF6转染后HLECs中Vimentin表达水平

RT-PCR琼脂糖凝胶电泳显示，KLF6组中Vimentin表达的亮度高于Vec组（图4A）；灰度分析结果显示，KLF6组中Vimentin表达水平显著高于Vec组中Vimentin表达水平，且差异具有统计学意义（P＜0.05）（图 4B）；q-PCR 显示，KLF6 组中 Vimentin表 达 量 显 著 高 于 Vec组 （图4C）。 说 明pEGFP-C2-KLF6转染致KLF6高表达后，HLECs中Vimentin的表达水平升高。

图3 pEGFP-C2-KLF6转染后HLECs中E-cadherin表达情况及定量分析。3A.琼脂糖凝胶电泳显示pEGFP-C2-KLF6转染后HLECs中E-cadherin表达情况 （RT-PCR）；3B.琼脂糖凝胶电泳的灰度分析结果；3C.pEGFP-C2-KLF6转染后HLECs中E-cadherin表达情况（q-PCR） Vec：空载体对照组 KLF6：pEGFP-C2-KLF6转染组 （KLF6高表达组） E-cadherin：上皮钙黏素 HLECs：人晶状体上皮细胞GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶

图4 pEGFP-C2-KLF6转染后HLECs中Vimentin表达情况及定量分析。4A.琼脂糖凝胶电泳显示pEGFP-C2-KLF6转染后HLECs中Vimentin表达情况（RT-PCR）；4B.琼脂糖凝胶电泳的灰度分析结果；4C.pEGFP-C2-KLF6转染后HLECs中 Vimentin表达情况 （q-PCR） Vec： 空载体对照组 KLF6：pEGFP-C2-KLF6转染组 （KLF6高表达组） Vimentin：波形蛋白 HLECs：人晶状体上皮细胞GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶

图5 pSilencer-KLF6转染后HLECs中E-cadherin表达情况及定量分析。5A.琼脂糖凝胶电泳显示pSilencer-KLF6转染后HLECs中E-cadherin表达情况 （RT-PCR）；5B.琼脂糖凝胶电泳的灰度分析结果；5C.pSilencer-KLF6转染后HLECs中E-cadherin表达情况（q-PCR） Vec：空载体对照组 siKLF6：pSilencer-KLF6转染组 （KLF6低表达组） E-cadherin：上皮钙黏素 HLECs：人晶状体上皮细胞GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶

2.5 pSilencer-KLF6转染后HLECs中E-cadherin表达水平

RT-PCR琼脂糖凝胶电泳显示，KLF6低表达组中E-cadherin的亮度高于Vec组（图5A）；灰度分析结果显示，siKLF6组中E-cadherin表达水平显著高于Vec组中E-cadherin表达水平，且差异具有统计学意（P＜0.05）（图 5B）。 q-PCR 显示，KLF6 低表达组中E-cadherin的表达量显著高于Vec组（图5C）。说明pSilencer-KLF6转染致KLF6低表达后，HLECs中E-cadherin的表达升高。

2.6 pSilencer-KLF6转染后 HLECs中Vimentin表达水平

RT-PCR琼脂糖凝胶电泳显示，KLF6低表达组中Vimentin表达的亮度低于Vec组（图6A）；灰度分析结果显示，siKLF6组中Vimentin表达水平显著低于Vec组中Vimentin表达水平，且差异具有统计学意义（P＜0.05）（图 6B）。q-PCR 显示，KLF6 低表达组中Vimentin表达量显著低于Vec组（图1C）。说明pSilencer-KLF6转染致KLF6低表达后，HLECs中Vimentin的表达水平降低。

2.7 Transwell细胞迁移实验

结果见图7。单纯TGF-β1刺激组中细胞迁移水平高于空白对照组（P＜0.05），且KLF6高表达组中发生迁移的细胞数量高于单纯TGF-β1刺激组 （P＜0.05），即在TGF-β1刺激下随KLF6的表达量增加，发生迁移的细胞数量相应提高。

2.8 pEGFP-C2-KLF6转染后，在TGF-β1刺激下，HLECs中Vimentin表达情况及定量分析

RT-PCR琼脂糖凝胶电泳显示，在TGF-β1刺激条件下，Vimentin表达量随KLF6表达量增加而提高（图8A）；灰度分析结果显示，在TGF-β1刺激下，KLF6高表达组中Vimentin表达水平显著高于Vec组中Vimentin表达水平，且差异具有统计学意义（P＜0.05）（图8B）。q-PCR显示，在TGF-β1刺激条件下，Vimentin表达量随KLF6表达量增加而提高（图8C）。说明加入TGF-β1刺激后，Vimentin表达量升高，随着KLF6的高表达，Vimentin表达量进一步增加。

图6 pSilencer-KLF6转染后HLECs中Vimentin表达情况及定量分析。6A.琼脂糖凝胶电泳显示pSilencer-KLF6转染后HLECs中Vimentin表达情况 （RT-PCR）；6B.琼脂糖凝胶电泳的灰度分析结果；6C.pSilencer-KLF6转染后HLECs中Vimentin表达情况（q-PCR） Vec：空载体对照组siKLF6：pSilencer-KLF6转染组（KLF6低表达组） Vimentin：波形蛋白 HLECs：人晶状体上皮细胞 GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶

图7 pEGFP-C2-KLF6转染后在TGF-β1刺激下HLECs细胞迁移情况。7A.Transwell细胞迁移实验观察各组HLECs迁移情况；7B.HLECs发生迁移的细胞数量 Vec：空载体 TGF-β1：转化生长因子-β1 KLF6：pEGFP-C2-KLF6转染（KLF6高表达） HLECs：人晶状体上皮细胞

2.9 pEGFP-C2-KLF6转染后，在TGF-β1刺激下，HLECs中E-Cadherin表达情况及定量分析

RT-PCR琼脂糖凝胶电泳显示，在TGF-β1刺激条件下E-Cadherin表达量随KLF6表达量升高而降低（图9A）；灰度分析结果显示，在TGF-β1刺激下，KLF6高表达组中E-Cadherin表达水平显著低于Vec组中E-Cadherin表达水平，且差异具有统计学意义（P＜0.05）（图 9B）。 q-PCR 显示，在 TGF-β1 刺激条件下，E-Cadherin表达量随KLF6表达量增加而降低（图9C）。说明加入TGF-β1刺激后，E-Cadherin表达量降低，随着KLF6的高表达，E-Cadherin表达量进一步减少。

3 讨论

EMT是上皮细胞在特定的生理或者病理情况下发生的细胞形态改变，细胞间黏附性降低，并向连接疏松，迁移能力更高的间质组织转化的过程[8]。EMT与多种类型的肿瘤侵袭密切相关[9、10]。在眼科领域中，EMT的发生可使晶状体上皮细胞增殖，迁移而引起PCO。

参与诱导和调控EMT过程的因素有很多，其中以TGF-β1诱导LECs发生EMT为众多研究者所熟知。研究显示[3]，白内障术后，房水内部环境发生改变，细胞因子TGF-β1促进LECs由立方形的上皮细胞向伸长的成纤维细胞表行转变，并抑制上皮标志蛋白E-cadherin的表达，LECs逐渐丧失黏附链接和缝隙链接，细胞骨架重组，细胞迁移性和运动增加，并获得基质细胞的标志如波形蛋白Vimentin。LECs发生EMT可引起细胞外基质固缩，从而引起后囊膜褶皱引起PCO。

图8 pEGFP-C2-KLF6转染后，在TGF-β1刺激下，HLECs中Vimentin表达情况及定量分析。8A.琼脂糖凝胶电泳显示pEGFP-C2-KLF6转染后，在TGF-β1刺激下HLECs中Vimentin表达情况（RT-PCR）；8B.琼脂糖凝胶电泳的灰度分析结果；8C.pEGFP-C2-KLF6 转染后，在 TGF-β1 刺激下，HLECs中 Vimentin 表达情况（q-PCR） Vec：空载体 TGF-β1：转化生长因子-β1 KLF6：pEGFP-C2-KLF6转染 （KLF6高表达） Vimentin：波形蛋白 HLECs：人晶状体上皮细胞GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶

图9 pEGFP-C2-KLF6转染后，在TGF-β1刺激下，HLECs中E-Cadherin表达情况及定量分析。9A.琼脂糖凝胶电泳显示pSilencer-KLF6转染后，在TGF-β1刺激下HLECs中E-Cadherin表达情况（RT-PCR）；9B.琼脂糖凝胶电泳的灰度分析结果；9C.pSilencer-KLF6转染后， 在TGF-β1刺激下，HLECs中 E-Cadherin表达情况 （q-PCR） Vec： 空载体TGF-β1：转化生长因子-β1 KLF6：pEGFP-C2-KLF6转染（KLF6高表达） E-cadherin：上皮钙黏素 HLECs：人晶状体上皮细胞 GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶

KLF6作为一种重要的肿瘤抑制基因，参与多种与TGF-β1传导相关的细胞增殖，纤维化等过程[12]。E-cadherin是一种钙离子依赖的细胞间黏附分子，属于I型钙黏蛋白，参与介导细胞间的同源黏附[13]。E-cadherin表达下调会导致同源细胞间黏附力下降，有利于肿瘤细胞脱离原发部位，向细胞外基质扩散。E-cadherin表达减少或缺失目前被认为是肺癌等恶性肿瘤中EMT现象的重要标志[14]。波形蛋白（vimentin）是细胞骨架蛋白之一，特异性的分布于间质细胞中，在上皮源性肿瘤中表达是发生EMT特征的表现，与细胞的生长分化状态以及细胞游走迁移有关。

鉴于PCO的发病机制尚不明确，本次研究采用真核质粒转染法将pEGFP-C2-KLF6（KLF6）和pSilencer-KLF6（siKLF6）分别转染到 HLECs中，并加入TGF-β1对细胞进行刺激，在KLF6高表达与低表达的水平下利用PCR方法检测EMT相关标记蛋白E-cadherin与Vimentin的表达水平，采用细胞迁移实验观察HLECs迁移能力的改变，以初步探讨KLF6在由TGF-β1诱导的晶状体上皮细胞纤维化过程中的调节作用。

本次研究结果显示（图 1，图 2）经 RT-PCR与q-PCR检测下我们成功建立了KLF6高表达与低表达的细胞模型。并发现当KLF6呈高表达时，HLECs中E-cadherin表达水平降低 （图3），同时Vimentin表达水平升高（图4）。当KLF6呈低表达时，HLECs中E-cadherin表达水平升高 （图5），同时Vimentin表达水平降低（图6）。同时，在TGF-β1刺激条件下（图8）细胞中Vimentin表达水平升高，且随着KLF6的高表达，Vimentin表达量进一步增加，并且在TGF-β1刺激条件下（图 9），细胞中 E-cadherin表达水平降低，且随着KLF6的高表达，E-Cadherin表达量进一步减少。由此可见，KLF6可以通过上调Vimentin高表达以及促进E-cadherin的低表达，进一步促进TGF-β1诱导的晶状体上皮细胞纤维化过程，从而为后发障的发生奠定了基础。

本次研究创新性体现在：我们首次报道KLF6蛋白对TGF-β1诱导的人晶状体上皮细胞纤维化的促进作用。利用KLF6特性我们可以针对性的设计KLF6的小干扰RNA，特异性的下调HLECs中KLF6的表达，从而内源性提高人晶状体上皮细胞的抗纤维化能力，进而抑制或延缓后发性白内障的发生发展。

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