油菜Bna-miR1140基因的分离与转化及其过表达分析

董 云，王 毅，靳丰蔚，吴旺泽，方 彦，徐妙云,王 磊

(1 甘肃省农业科学院 作物研究所，兰州 730070; 2 西北师范大学 生命科学学院，兰州 730070；3 甘肃农业大学 干旱生境作物学重点实验室，兰州 730070； 4 中国农业科学院 生物技术研究所，北京 100081)

农业生产中，通过增加种植密度来提高产量是一个重要的育种目标，同时，紧凑的株型有利于中、后期的田间管理和机械化采摘，可以提高劳动生产率、减轻劳动强度和降低生产成本[1]。因为株型发育对作物的重要意义，各国学者通过QTL和突变体资源鉴定到了一些调控株型发育的基因，像水稻LAZY1[2]、玉米ZmLAZY1[3]、拟南芥AtLAZY1和ATLPA1等调控了植物叶、茎分枝等株型发育[3]。另外生长素的不对称分布以及生长素合成和转导途径调控的茎向地性也影响植物株型发育[4]。油菜是中国重要的油料作物之一，同时也是发展能源农业的优良经济作物。株型性状是油菜重要的数量性状，涉及到分枝夹角、植株高度、分枝数、分枝部位高度、结角密度、主花序有效角果数等性状，由主效基因控制[5-6]。油菜株型发育对油菜产量和机械化收割具有重要意义，然而油菜株型发育的调控机理目前还不清楚[7]。

miRNAs是一类在进化上保守的长约21nt的非编码单链RNA，主要在转录后通过介导靶mRNA降解或翻译抑制来调控基因的表达水平，在生物体生长发育过程、生物或者非生物胁迫中起着非常重要的作用[8-9]。油菜复杂的分枝系统，是模式植物拟南芥和水稻所不具备的。研究miRNA参与调控油菜分枝形成和发育的遗传控制机理具有重要意义。前期的研究结果表明Bna-miR1140是芸薹属特异miRNA[10]，并通过降解组测序分析得到Bna-miR1140的靶基因为一种糖基转移酶(glycosyltransferase)和响应调节因子(Arabidopsis response regulator ARR8-like protein)[11]，但Bna-miR1140参与调控株型发育的机理目前还不清楚。为了进一步了解Bna-miR1140参与油菜株型发育的生物学功能，我们对芸薹属特异的miRNA家族Bna-miR1140前体在油菜中进行过表达研究，以期初步了解Bna-miR1140参与油菜株型发育的表达调控机制，为油菜品种改良和油菜miRNAs调控机制的研究提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材 料

甘蓝型油菜(BrassicanapusL.)栽培种westar，由甘肃省农业科学院作物研究所提供。

1.2 方 法

1.2.1油菜Bna-miR1140基因的分离根据Bna-miR1140前体序列设计引物，上游引物Bna-miR1140Fw的5′端添加XbaⅠ酶切位点，下游引物Bna-miR1140Rv的5′端添加SacⅠ酶切位点；测序引物NOS70按照植物表达载体pPZP212上NOS终止子序列设计；鉴定引物35SFw和35S50按照35S∷Bna-miR1140构建设计。本研究所用引物序列详见表1，均由上海生物工程有限公司合成。以CTAB法[12]从油菜幼苗中提取的DNA为模板，PCR扩增197 bp的Bna-miR1140前体序列片段。PCR反应体系：Taq(2 U/μL) 0.5 μL，10×Taq反应缓冲液2.0 μL，dNTP mix (10 mmol/L) 0.5 μL，Bna-miR1140 Fw (10 μmol/L) 0.5 μL，Bna-miR1140 Rv (10 μmol/L) 0.5 μL，油菜DNA 1.0 μL，dH2O 15 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性40 s，57.9 ℃退火40 s,72 ℃延伸40 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min。

1.2.2油菜Bna-miR1140基因的过表达载体构建取2.0 L PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，粗略估计PCR产物的扩增量。根据PCR产物量，按照载体pEASY-T1Cloning Vector使用说明进行T连接反应，反应结束后转化大肠杆菌Trans1-T1。通过蓝白斑筛选得到的单克隆，经PCR和酶切鉴定后，送北京中科希林生物公司用引物M13﹢进行测序验证。用限制性内切酶XbaⅠ和SacⅠ对pPZP212质粒和测序正确的pEASY-T1-miR1140质粒进行双酶切，凝胶电泳切胶回收10 095和197 bp DNA片段，胶回收后的Bna-miR1140基因前体片段和pPZP212载体片段用T4DNA连接酶按照摩尔比6∶1，在恒温16 ℃条件下连接过夜。取2 LBna-miR1140基因前体片段与pPZP212载体片段连接的溶液，转化大肠杆菌感受态Trans1-T1，再PCR和酶切鉴定阳性重组子35S∷Bna-miR1140，对鉴定正确的阳性重组子，摇菌后送北京中科希林生物公司用引物NOS70进行测序验证。测序验证正确的阳性重组子35S∷Bna-miR1140电击转化农杆菌LBA4404。

表1 引物名称及序列

1.2.3油菜的转化及阳性植株鉴定按照Prem L Bhalla和Mohan B Singh的方法[13]，通过农杆菌介导浸染油菜子叶柄转化油菜。经kanamycin不同梯度培养筛选到的生根壮苗炼苗移栽后，用CTAB法提取其DNA，35SFw/Bna-miR1140 Rv和35S50/Bna-miR1140 Rv两对鉴定引物分别进行PCR扩增，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，扩增出511 bp和253 bp条带的为阳性株。

1.2.4过表达35S∷Bna-miR1140的T0代转化株及T1代表型分析以野生型油菜和转化空载体pPZP212的T0代阳性株作对照，对PCR鉴定呈阳性的过表达35S∷Bna-miR1140的T0代转化株进行表型观察，包括叶片形态、花器结构、株型等，并统计分析株高、分枝部位、一次分枝、二次分枝、主花序长度、全株有效角果数、单株生产力、千粒重等。

选取分枝数多、PCR鉴定呈阳性的5株过表达35S∷Bna-miR1140的T0代转化株系结的种子，在河北廊坊中国农业科学院试验基地春播，试验统一采用随机区组排列，3次重复，小区面积2 m2，10行区，油菜保苗株数35株/m2。对照为野生型油菜栽培种westar和转化空载体pPZP212的油菜T1代。试验地土壤肥力和施肥水平同当地大田生产条件。生育期间观察记载出苗期、现蕾期、抽薹期、开花期、终花期、成熟期，并于盛花期调查每小区中株型有变异、分枝数多的株数。

2 结果与分析

2.1 油菜Bna-miR1140基因的分离

本研究选取Bna-miR1140 (MI0006482)为研究对象(图1)。以油菜DNA为模板，Bna-miR1140 Fw为正向引物，Bna-miR1140 Rv为反向引物， PCR扩增Bna-miR1140基因的前体序列，片段长197 bp(图2，a)。PCR产物与pEASY-T1连接后，利用引物Bna-miR1140 Fw和Bna-miR1140 Rv，酶NcoⅠ/HindⅢ、SacⅠ，分别对质粒Bna-miR1140-pEASY-T1进行PCR、双酶切及单酶切鉴定，结果质粒PCR条带和酶切条带大小均为200 bp左右(图2，b～d)，说明Bna-miR1140基因的前体序列PCR产物成功连接到克隆载体。并对Bna-miR1140-pEASY-T1测序验证，序列长197 bp，与miRbase18.0中比对结果一致，证明PCR扩增产物为Bna-miR1140基因的前体序列，符合后续实验中表达载体构建和表达分析的要求。

2.2 油菜Bna-miR1140植物过表达载体的构建

通过用SacI和XbaI分别双酶切植物表达载体质粒pPZP212和测序验证正确的克隆质粒pEASY-T1-miR1140(图3，a)，切胶回收197和10 095 bp质粒酶切片段(图3，b、c)，再用T4DNA连接酶将回收的Bna-miR1140基因前体片段和pPZP212载体片段连接。转化大肠杆菌感受态后，以其质粒DNA为模板，用引物Bna-miR1140 Fw和Bna-miR1140 Rv 进行了PCR扩增，对扩增结果与PCR鉴定克隆载体Bna-miR1140-pEASY-T1结果一致的质粒，用酶NcoⅠ、EcoR Ⅰ/XbaⅠ、SacⅠ/PstⅠ分别进行单酶切和双酶切，酶切结果见图3，d～f。NcoⅠ单酶切产生的2个片段大小分别为1 317和698 bp，EcoRⅠ/XbaⅠ双酶切产生的片段大小462 bp，SacⅠ/PstⅠ双酶切产生的片段大小1 050 bp，3次酶切片段大小符合理论值。PCR和酶切均鉴定为阳性的重组子35S∷Bna-miR1140经测序验证后，得到的序列与克隆载体pEASY-T1-miR1140测序结果一致，说明Bna-miR1140基因前体片段连接到表达载体pPZP212上(图4)。

红色碱基为miR1140成熟序列图1 油菜Bna-miR1140前体二级结构发卡图The mature nucleotides of miR1140 are red nucleotidesFig.1 Stem-loop structure of Bna-miR1140 precursors

a. 以油菜DNA为模板扩增Bna-miR1140基因片段；b. Bna-miR1140-pEASY - T1的PCR鉴定；c. Nco Ⅰ/Hind Ⅲ 双酶切鉴定Bna-miR1140-pEASY-T1； d. Sac Ⅰ单酶切鉴定Bna-miR1140-pEASY-T1A.以油菜DNA为模板PCR扩增Bna-miR1140基因的前体序列；B.以Bna-miR1140-pEASY-T1的质粒为模板PCR扩增Bna-miR1140基因的片段；C. Nco Ⅰ/Hind Ⅲ 双酶切鉴定Bna-miR1140-pEASY-T1；D. Sac Ⅰ单酶切鉴定Bna-miR1140-pEASY-T1；M. DNA分子量标准；N. 阴性对照图2 油菜Bna-miR1140基因的克隆和鉴定a. PCR amplification for the precursor fragments of Bna-miR1140 from cDNA of B. napus; b. Identification of Bna-miR1140-pEASY-T1 by PCR; c. Identification of Bna-miR1140-pEASY-T1 by Nco Ⅰ/Hind Ⅲ double enzyme digestion; d. Identification of Bna-miR1140-pEASY-T1 by Sac Ⅰ enzyme digestionA. PCR amplification for the precursor fragments of Bna-miR1140 from cDNA of B. napus; B. PCR amplification for the precursor fragments of Bna-miR1140 from Bna-miR1140-pEASY-T1；C. Identification of Bna-miR1140-pEASY-T1 by Nco Ⅰ/Hind Ⅲ double enzyme digestion; D. Identification of Bna-miR1140-pEASY-T1 by Sac Ⅰ enzyme digestion; M. marker; N. Negative controlFig.2 PCR amplification for the precursor fragments of Bna-miR1140 and identification

a．Sac Ⅰ/Xba Ⅰ对pPZP212和pEASY-T1-miR1140的酶切；b. pPZP212酶切片段的胶回收；c. pEASY-T1-miR1140酶切后胶回收的Bna-miR1140片段；d. Nco Ⅰ单酶切鉴定35S∷Bna-miR1140；e. EcoR Ⅰ/Xba Ⅰ双酶切鉴定35S∷Bna-miR1140；f. Sac Ⅰ/Pst Ⅰ双酶切鉴定35S∷Bna-miR1140；A. Sac Ⅰ/Xba Ⅰ对载体pPZP212的酶切产物；B. Sac Ⅰ/Xba Ⅰ对pEASY-T1-miR1140的酶切产物；C. 胶回收酶切pPZP212后的载体片段；D. pEASY-T1-miR1140酶切后胶回收的Bna-miR1140片段； E. Nco Ⅰ酶切鉴定35S∷Bna-miR1140；F. EcoR Ⅰ/Xba Ⅰ双酶切鉴定35S∷Bna-miR1140；G. Sac Ⅰ/Pst Ⅰ双酶切鉴定35S∷Bna-miR1140；M. DNA分子量标准图3 过表达载体35S∷Bna-miR1140的构建和酶切鉴定a. pPZP212 and pEASY-T1-miR1140 were digested by enzyme Sac I/Xba I; b. Fragment of pPZP212 recovered after enzyme digestion; c. Fragment of Bna-miR1140 recovered from pEASY-T1-miR1140 after enzyme digestion; d. Identification of 35S∷Bna-miR1140 by Nco Ⅰ digestion; e. Identification of 35S∷Bna-miR1140 by EcoR Ⅰ/Xba Ⅰ digestion; f. Identification of 35S∷Bna-miR1140 by Sac Ⅰ/Pst Ⅰ digestionA. pPZP212 was digested by enzyme Sac Ⅰ/Xba Ⅰ；B. pEASY-T1-miR1140 was digested by enzyme Sac Ⅰ/Xba Ⅰ；C. Fragment of pPZP212 recovered after enzyme digestion；D. Fragment of Bna-miR1140 recovered from pEASY-T1-miR1140 after enzyme digestion； E. Identification of 35S∷Bna-miR1140 by Nco Ⅰ digestion；F. Identification of 35S∷Bna-miR1140 by EcoR Ⅰ/Xba Ⅰ digestion； G. Identification of 35S∷Bna-miR1140 by Sac Ⅰ/Pst Ⅰ digestion；M. DNA markerFig.3 Construction of overexpression vector 35S∷Bna-miR1140 and identification by enzyme digestion

2.3 过表达载体35S∷Bna-miR1140转化油菜和转基因苗筛选

转化了过表达载体35S∷Bna-miR1140的农杆菌LBA4404(OD650 0.5)悬浮液，共计浸染400个附带2 mm叶柄的油菜子叶，在恢复培养后，进行了愈伤诱导，总共诱导出愈伤388个，出愈率97%。选取无褐化、无污染的愈伤320个，在低浓度25 mg/L kanamycin抗性芽诱导培养基中生长，诱导出芽107个，芽诱导率 33.4%。挑取生长健壮、无污染和无褐化的99个发生芽，继续在低浓度25 mg/L kanamycin抗性芽生长培养基中生长4周，然后转移至高浓度50 mg/L kanamycin抗性筛选培养基中生长4周(图5，a、b)，筛选出绿苗数25个，白化苗39个，坏死和污染的苗35个。将所有绿苗转接到生根培养基上，1月后发生根的苗数为24株(图5，c)，出根率为57.6%。通过高浓度50 mg/L kanamycin抗性筛选后，将初步确定为阳性的24株抗性转化植株苗炼苗后，移栽在花盆中进行培养(图5，d)。

图4 表达载体35S∷Bna-miR1140 T-DNA区结构Fig.4 The structure of T-DNA region in expression vector of 35S∷Bna-miR1140

2.4 转化35S∷Bna-miR1140油菜株的PCR鉴定

以提取的24株转化35S∷Bna-miR1140的油菜苗基因组DAN为模板，利用35S Fw/Bna-miR1140-1140 Rv和35S50/Bna-miR1140-1140 Rv两对引物，分别对这些DNA进行PCR扩增，野生型(WT)作为阴性对照，大肠杆菌质粒Bna-miR1140-pPZP212作为阳性对照。琼脂糖凝胶电泳检测后， 35SFw/Bna-miR1140-1140 Rv有20株扩增出目的条带(图6，a～c)，35S50/Bna-miR1140-1140 Rv仅14株扩增出目的条带，且与35S FW/Bna-miR1140-1140 Rv的PCR鉴定为阳性的植株均对应(图6，d、e)，并且2对引物分别扩增出的片段大小与阳性对照相同，条带大小分别为511 和253 bp，从而最终确定过表达Bna-miR1140基因的转基因油菜共14株。

2.5 转化35S∷Bna-miR1140油菜株T0代表型分析

以野生型油菜和转化空载体pPZP212的T0代阳性株作对照，对PCR鉴定呈阳性的过表达35S∷Bna-miR1140的T0代转化株进行表型观察，结果显示，过表达Bna-miR1140油菜株叶片形态、花器结构没有变异，均与对照相同，但其中有5株过表达Bna-miR1140油菜株株型表现与对照差异较大，过表达Bna-miR1140油菜株出现双主序表型，分枝数较对照明显增多(图7)。由表2可见，过表达Bna-miR1140油菜株的株高、主花序长度、主花序结角数和千粒重都与对照相当，而分枝部位较对照低，分枝数增多，致使全株有效角果数增多，从而使单株生产力较对照高26%。

a、b. 抗性筛选，红色箭头标注为白化苗；c.根诱导；d. 炼苗图5 过表达载体35S∷Bna-miR1140转化油菜及阳性苗抗性筛选a, b. Selection of transgenic shoots with kanamycin, red arrows directed albinoes; c.Root initiation; d. Seedling hardeningFig.5 B. napus transformed with 35S∷Bna-miR1140 and kanamycin screening of positive seedling

a～c. 35SFw/ Bna-miR1140-1140Rv扩增；d、e. 35S50/ Bna-miR1140-1140Rv扩增；P. 阳性对照；N. 阴性对照；M. DNA分子量标准；1～24. 转基因油菜T0代株系图6 过表达Bna-miR1140的T0代油菜转化株PCR鉴定a-c. PCR amplification by primers 35SFw and Bna-miR1140-1140Rv; d and e. PCR amplification by primers 35S50 and Bna-miR1140-1140Rv; P. Positive control; N. Negative control；M. Marker; 1-24. Transgenic B. napus T0 linesFig.6 Identification of transgenic B. napus T0 lines with PCR

a. 转化空载体pPZP212 T0代油菜株(CK)；b～f. 过表达Bna-miR1140的T0代油菜转化株图7 过表达Bna-miR1140的T0代油菜转化株成株期表型a. pPZP212 transformed T0 lines(CK); b-f. Bna-miR1140 transformed T0 linesFig.7 Phenotype at adult stage of Bna-miR1140 transgenic T0 lines

株高Plantheight/cm分枝数Branchnumber主花序长度Lengthof maininflorescence/cm主花序结角数Silique mumberof main inflorescence全株有效结角数Totalavailable silique角粒数Seedsper silique角果长度Siliquelength/cm千粒重Grainweight/g单株生产力Yeild per plant/gWT10974833149225.52.59.5pPZP212113643331302462.59Bna-miR11401221246362002562.512

注：表中数据为所考单株的平均值

Note: the data are all average in table

表3 转化35S∷Bna-miR1140油菜株T1代田间物候期(日/月)

表4 转化35S∷Bna-miR1140油菜株T1代株型变异株观测值及卡方检验

2.6 转化35S∷Bna-miR1140油菜株T1代田间表型分析

由表3可见，各小区出苗期一致，但在现蕾期及以后的各时期中，5株过表达35S∷Bna-miR1140的T1代转化株系生育期整体推迟。经方差分析和多重比较，过表达35S∷Bna-miR1140的T1代转化株系与对照间全生育期差异极显著，全生育期较对照延长9～14 d。

对过表达35S∷Bna-miR1140的T1代转化株系小区中的株型有变异、分枝数多的株数进行了调查统计，结果见表4。经卡方检验，除株系OE4-Bna-miR1140外，其余4个株系OE1-Bna-miR1140、OE2-Bna-miR1140、OE3-Bna-miR1140和OE5-Bna-miR1140等 T1代均符合3:1的孟德尔分离规律。

3 讨 论

株型育种是作物高产育种的重要内容，选育理想的油菜株型一直是油菜育种者追求的重要目标之一。关于油菜理想株型的研究较多，有的研究用无花瓣材料构建理想株型[14]，有的用双主序构建理想油菜株型[15]；一些研究还认为株高适中、分枝数适中、株型紧凑型的品种是理想的株型[16]。2000年赵继献对4个油研品种的株型结构以及性状间的相关性研究表明，分枝角度、分枝长度、分枝粗、节间长是株型结构的主要特征[6]，这些研究均为油菜理想株型的选育提供了理论依据。株型性状一般认为属于多基因控制的数量性状，但对于其遗传效应的分析却了解甚少，大多数株型性状与单株产量以及产量构成性状之间均存在显著或极显著的遗传相关[17]。尽管油菜分枝系统非常复杂，但对油菜生产具有重要意义，目前对油菜分枝调控的遗传规律和分子机理还不清楚。

高等植物茎的分枝系统决定了形态各异的株型结构，植物通过在叶腋中形成新的分生组织产生分枝，分枝的形成受到植株发育阶段、环境因素和激素的严格调控[18]。最近大量的研究表明miRNA调控了植物生长发育的各个方面，miRNA靶标中的50%左右是在发育模式中起重要作用的转录调控因子[19]。在拟南芥中miR159家族通过负调控几个TCP和MYB转录因子家族成员，参与叶的发育[20]，miR160通过对ARF10、ARF16和ARF17转录本的切割，调控芽和根的发育[21]，miR164靶向基因CUC1、CUC2和CUC3能够调控腋芽顶端分生组织从而影响抑制植物分枝的发育[22-23]。我们前期的研究结果表明Bna-miR1140是芸薹属特异miRNA[10]，Bna-miR1140的靶基因为一种糖基转移酶(glycosyltransferase)和响应调节因子(Arabidopsis response regulator ARR8-like protein)[11]。糖基转移酶能催化糖转变为各种受体分子介导植物生长发育，在植物中是一个超家族基因，在拟南芥中有超过350个糖基转移酶基因[24]。在拟南芥中超表达西洋参糖基转移酶基因PgUGT72AL1，导致腋下叶分支纹理，植株株型变化[25]；在苹果中沉默根皮素酚特异的糖基转移酶基因UGT88F1导致了节间缩短，狭窄叶的株型变化[26]。我们通过降解组测序分析得到油菜Bna-miR1140的靶基因为一种糖基转移酶，在油菜中过表达油菜Bna-miR1140前体序列，14株T0代油菜阳性株中有5株表现双主序表型，分枝数明显增多，其他9株阳性株均与野生型油菜表型一致；卡方检验分枝数增多、株型有变异的5个株系的T1代表型，结果发现其中4株的株型变异遗传符合3∶1的孟德尔分离规律，说明油菜Bna-miR1140的确调控了株型的发育，但Bna-miR1140如何调控糖基转移酶基因来影响油菜株型发育我们不得而知。我们下一步的工作将通过酵母双杂和CoIP的试验从分子机理去揭示Bna-miR1140如何和糖基转移酶相互作用来参与油菜株型发育。

除了糖基转移酶为油菜Bna-miR1140的靶向基因，我们的研究也发现拟南芥响应基因ARR8-like protein也是Bna-miR1140的调控靶基因。我们知道生长素的不对称分布以及生长素合成和转导途径调控的茎向地性也会影响植物株型发育[4]，而ARR基因的表达又受到生长素的调控，像ARR5基因在根和茎顶端分生组织高效表达，可能和株型发育相关[27]。arr345689六突对生长素的调控极其敏感，而生长素的分布及合成会影响茎的向地性，从而影响株型发育[28]，ARR家族中ARR4和ARR8也涉及到生长素的信号转导[29]。这些研究表明ARR通过生长素的调控参与株型发育，也间接说明我们对Bna-miR1140的参与调控株型发育的靶基因ARR8-like protein的筛选是可信的，后期的研究将从生长素调解方面对Bna-miR1140参与的株型发育进行深入研究。总之，我们在油菜过表达Bna-miR1140前体序列的研究表明，转基因油菜的株高、主花序长度、主花序结角数和千粒重都没有发生明显变化，而分枝部位较对照降低，分枝数增多，致使全株有效角果数增多，从而使单株生产力较对照高26%。具体油菜Bna-miR1140如何通过调控靶向糖基转移酶和ARR8-like protein参与株型发育的分子机理我们还不清楚，将来的研究将从这方面阐述Bna-miR1140参与油菜株型调控的分子机理。

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