杨树舌菌丝体多糖提取条件优化研究

陈晓鑫　夏鑫梓　林长锋　张　跃　陈　欣　于加平

（吉林农业科技学院生物工程学院，吉林　吉林　132101）

树舌［Ganoderma applanatum（Pers.Ex Wallr）Pat.］隶属于真菌门担子菌亚门层菌纲灵芝目灵芝科灵芝属［1］，又被称为平盖灵芝、扁木灵芝、赤色老母菌等，分布于东北、西北、华东、华南、西南各省区，在我国资源丰富［2］。野生树舌多生于杨、桦、柳、栎等阔叶树的枯立木、倒木和伐桩上［3］。目前对树舌的研究主要集中在其子实体多糖及人工栽培等方面，而对运用液体深层发酵技术得到的菌丝体中的多糖研究却鲜见报道。因此，本文以热水浸提法提取杨树舌菌丝体多糖，采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，通过考察浸提温度、料液比、pH值和浸提次数4种影响因素，分别对其进行单因素试验，然后采用正交试验法优化，最终得出杨树舌菌丝体多糖最佳提取条件。

1　材料、设备与试剂

1.1　材料

杨树舌菌丝体：经过野生子实体（采自吉林省通化市二道江区桃园村）分离，采用液体深层发酵得到菌丝体，阴干、低温烘干，粉碎，置于干燥器中备用。

1.2　仪器设备

ZHJH-C1214C型超净工作台（上海新苗医疗器械制造有限公司），IS-RDS3C型叠加式恒温振荡箱（常州万合仪器制造有限公司），UV-9100型紫外分光光度计（上海光谱仪器有限公司），FA1004A型电子分析天平（上海精密科学仪器有限公司），ZW-FX-50L型旋转蒸发仪（深圳市能易仪器有限公司）。

1.3　试剂

葡萄糖、蛋白胨、琼脂、碳酸氢钠（沈阳市新化试剂厂），硫酸镁（含7个结晶水）、维生素B1（天津基准化学试剂有限公司），氢氧化钠、盐酸、无水乙醇、苯酚（浙江王龙科技有限公司），浓硫酸、丙酮、氯仿（潍坊日兴化工有限公司），正丁醇（天津市福晨化工试剂厂），磷酸二氢钾、磷酸氢二钾（天津市瑞金特化学品有限公司），所述试剂均为分析纯。

2　试验方法

2.1　杨树舌菌丝体的获得

将野生杨树舌子实体进行菌种分离操作，培养得到斜面母种。将分离得到的菌丝体作为液体菌种培养的原材料，在24℃、150 r/min的恒温振荡器中进行液体培养10 d后，接入发酵罐中进行液体深层培养，得到菌丝体。

2.2　杨树舌菌丝体多糖含量的测定

2.2.1杨树舌菌丝体中多糖的提取与纯化。称取液体深层发酵中所得的菌丝体粉碎后放入烧杯中，加入相应体积的蒸馏水于恒温水浴锅中浸提，将提取液离心后，残渣按照相同方法继续浸提，煮沸的过程中需搅拌过滤。将滤液合并后浓缩至原液的1/2，然后根据Sevage法去蛋白，经离心机分离，取上清液。于蒸馏水中透析48 h，透析完成后，在提取液中加入95%无水乙醇（使提取液中醇浓度达到85%以上），放于4℃冰箱中沉淀48 h。离心分离得到沉淀，将其放入含有无水乙醇溶液的烧杯中洗2次，再用乙醚、丙酮用同样的方法各洗2次，最终将得到的杨树舌菌丝体多糖放入烘箱中干燥至恒质量，置于干燥器皿中备用。

2.2.2标准曲线的绘制。准确称量25 mg无水葡萄糖，放于容量瓶中定容至250 mL，使其葡萄糖溶液浓度为0.1 mg/mL。分别移取上述标准溶液，将其按不同的体积（0.1～0.7 mL）分别加入7只试管中，然后依次加入蒸馏水，使每只试管中的溶液最终体积为1 mL，另取1 mL蒸馏水作为对照。每只试管加入5%苯酚溶液1 mL，摇匀并迅速加入浓硫酸5 mL，然后将其放到冷水中进行冷却（放置30 min），待冷却到室温后摇匀5 min，在490 nm处测得吸光度，绘制标准曲线，得回归方程为A=1.029 3C+0.009 6，R=0.999 9。

2.2.3换算因子f的测定。准确称取2.2.1中所得的杨树舌菌丝体精制多糖1 mg，定容至50 mL，使其浓度达到Cx=0.02 mg/mL。用移液管移取1 mL杨树舌菌丝体多糖溶液于试管中，加入5%苯酚溶液1 mL后振荡混匀，随即迅速向试管中加入浓硫酸5 mL，将其摇匀后并充分反应，放入冷水中待冷却至室温后，在490 nm处测定吸光度值，得A=0.112，带入回归方程可得Cf=0.015，得到换算因子f=Cx/Cf=1.33。

2.3　杨树舌菌丝体多糖提取的单因素试验

2.3.1不同温度提取杨树舌菌丝体多糖。分别称取5份等同质量菌丝体于烧杯中，并向其中加入等同体积的蒸馏水，于恒温水浴锅中浸提2 h，浸提温度分别设置为80、85、90、95 ℃和100 ℃，进行提取，按2.2.2进行测定。

2.3.2不同料液比提取杨树舌菌丝体多糖。分别称取4份等同质量菌丝体于烧杯中，浸提中干粉∶水分别为1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（W/V，g/mL），浸提温度为95 ℃，浸提时间为2 h，进行提取，按2.2.2进行测定。

2.3.3不同pH值提取杨树舌菌丝体多糖。称取4份等同质量菌丝体于烧杯中，浸提中料液的pH值分别为5、6、7、8，浸提温度为95 ℃，料液比为1∶20（g/mL），浸提时间为2 h，进行提取，按2.2.2进行测定。

2.3.4不同浸提次数提取杨树舌菌丝体多糖。用电子天平分别称取4份等同质量菌丝体于烧杯中，95℃下浸提2 h，浸提时料液比为1∶20（g/mL），pH值为7，进行提取，浸提液离心后对残渣按同样方法再进行多次提取，按2.2.2进行测定。

3　结果与分析

3.1　杨树舌菌丝体多糖提取单因素试验

3.1.1温度对菌丝体多糖提取的影响。按照2.3.1所述方法，测定不同浸提温度对菌丝体多糖含量的影响，如图1所示。

图1　不同温度对多糖提取的影响

由图1可知，在其他条件不变的情况下，设定不同浸提温度对多糖进行提取，可以得出温度影响多糖浸出率。随着温度的升高，多糖含量逐渐增加。当温度为95℃时，多糖含量达到最高峰值；而温度超过95℃后，多糖的浸出率开始减少。由此可知，95℃为杨树舌菌丝体的最佳浸提温度。

3.1.2料液比对菌丝体多糖提取的影响。按照2.3.2所述方法，测定不同料液比对菌丝体多糖含量的影响，结果如图2所示。

图2　不同料液比对多糖提取的影响

由图2可知，料液比不同，多糖含量存在差异，多糖含量随着料液比量的增加而增加。当料液比由1∶10（g/mL）增大至1∶20（g/mL）时，菌丝体中多糖含量达到最高；但当料液比量继续增加时，多糖含量却随之减少。随着料液比的不断增加，所需使用的提取剂蒸馏水的用量也不断增加，溶解在溶剂中的溶质却不断减少，后续浓缩液体所需时间较长、效率较低，使得成本与收益相差甚远。综合考虑，料液比选择1∶20（g/mL）较为合适。

3.1.3pH值对菌丝体多糖提取的影响。按照2.3.3所述方法，研究不同pH值对菌丝体多糖含量的影响，如图3所示。

图3　不同pH值对多糖提取的影响

由图3可知，在其他条件不变的情况下，设定不同pH值对多糖进行提取，可以看出pH值影响着多糖含量。随着pH值的变化，溶液由酸性变为碱性，多糖含量随即发生变化。当pH值为7时，多糖含量达到最高峰值。而当pH值继续增加时，多糖含量却开始下降。因此，pH值为7较为合适。

3.1.4浸提次数对菌丝体多糖提取的影响。按照2.3.4所述方法，研究不同提取次数对菌丝体多糖提取率的影响，如图4所示。

图4　不同浸提次数对多糖提取的影响

由图4可知，在其他条件不变的情况下，只考虑浸提次数对多糖含量的影响。由浸提次数1次变为2次时，多糖含量明显增加2倍，但当浸提次数继续不断增加时，多糖含量呈现缓慢增加的趋势。由此可知，浸提次数是提取多糖时的一个重要影响因素。如果提取次数过少，杨树舌菌丝体中的多糖不能完全被提取出来，无法得到较多的多糖，造成原材料与试剂的浪费，导致经济效益降低。而提取次数过多，无异于增大了浸提液的体积，使得后续浓缩处理、醇沉等步骤增加时间，降低试验效率。综合考虑，选择合适的浸提次数对于多糖提取工艺是至关重要的。因此，浸提次数选择2次。

3.2　杨树舌菌丝体多糖提取条件优化

根据杨树舌菌丝体多糖提取单因素试验结果，可选取适当的因素与水平，设计L9（34）正交试验，进行3次重复，对杨树舌菌丝体多糖提取条件进一步优化。表1为正交试验因素水平对照表，表2为正交试验结果。

由表2结果可知，不同组合的多糖含量各不相同，存在一定的差异。根据极差R数值的大小对杨树舌菌丝体多糖提取条件的影响因素进行主次排序，依次为D＞A＞C＞B，选取合适的水平组合为A2B2C2D2，由此可得出当浸提温度为95℃，料液比为1∶20，pH值为7，浸提次数为2时，是杨树舌菌丝体多糖的最佳提取工艺条件。以最优组合进行验证试验，此时的提取率高达113.4 mg/g。

表1　正交试验因素水平表

表2　正交试验数据结果

4　结论

试验结果表明，杨树舌菌丝体最佳提取工艺条件是浸提温度为95℃，料液比为1∶20，pH值为7，浸提次数为2次，此时多糖含量可达113.4 mg/g。本文通过对液体深层培养获得的杨树舌菌丝体，采用热水浸提法对其多糖提取有着较为稳定的效果，而且此工艺提取过程简单、测定方法简便，成本较低，可用作此类真菌多糖的提取工艺，可为杨树舌多糖实现工业化生产奠定基础，推动杨树舌多糖的开发与利用。