单倍体相合造血干细胞移植联合脐带间充质干细胞输注治疗儿童重型再生障碍性贫血的临床观察及安全性分析

井远方 卢伟 唐湘凤

重型再生障碍性贫血（severe aplastic anemia，SAA）是一类骨髓衰竭性疾病且好发于少年儿童群体，其发病机制与造血干细胞功能缺陷、造血微环境破坏、免疫损伤等多种病理生理改变有关[1]。目前异基因造血干细胞移植是治愈SAA的唯一方法，但多数患者受到人白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）配型限制，此时行单倍体相合造血干细胞移植（haploidentical hematopoietic stem cell transplantation，hi-HSCT）为改善患儿预后质量的重要手段[2]。为预防hi-HSCT后移植物抗宿主病（graft-vs-host disease，GVHD）的发生，临床推荐以脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSC）输注，从而保证治疗成功率、降低恶性血液病复发风险[3]。海军总医院儿科于2010年2月至2014年1月，将hi-HSCT联合hUC-MSC输注用于11例SAA患儿的治疗，取得了较好的效果，现总结如下。

资料与方法

一、研究对象

以海军总医院儿科2010年2至2014年1月收治的11例SAA患儿为研究对象，进行回顾性分析。患儿均符合《血液病诊断及疗效标准》中关于SAA的诊断描述[4]，因未找到HLA全相合供者而接受hi-HSCT联合hUC-MSC输注治疗，且随访时间≥12个月，排除临床资料不完整者、中途失访者，以及随访期间新加入其它研究者。11例患儿中，男4例，女 7例，年龄 3 ～ 13岁，平均（9.18±3.06）岁，病程 2 ～ 11 年，平均（6.81±2.69）年，其中 2 例既往有免疫治疗失败史，其余9例均为初次接受治疗。供者均为亲缘供者，其中母供子6例，父供子3例，同胞供者2例；女供男1例，男供女4例，女供女3例，男供男3例。以序列特异性引物聚合酶链反应（PCR-SSP）法确定供受者HLA-A、HLA-B、ABODR位点，其中1个位点不合者2例，2个位点不合者3例，3个位点不合者6例；ABO血型相合7例，主侧血型不合1例，次侧血型不合3例。

二、治疗方案

（一）供者干细胞动员

供者均接受重组人粒细胞集落刺激因子（rhGCSF）皮下注射，每日 1次，每次 5 μg/kg，持续 5 ～6 d，第5 d于硬膜外麻醉下采集其骨髓干细胞200 ～600 ml，使用血细胞分离机采集外周血干细胞并经静脉输注至受者体内，根据外周血干细胞数量确定是否实施二次输注[5]：需确保有核细胞（MNC）计数≥ 5×108/受者 kg、CD34+计数≥ 3×106/受者 kg。

（二）预处理及hUC-MSC输注

患儿均于移植前7 d ～移植前2 d接受兔抗人胸腺细胞球蛋白、环磷酰胺联合Bu预处理，预处理方案：兔抗人胸腺细胞球蛋白10 mg/kg静脉滴注，每日1次（分4剂）；环磷酰胺50 mg/kg静脉滴注，每日1次，持续4 d；Bu 1.0 mg/kg静脉泵入，每6 h 1次。移植当天回输供者骨髓，骨髓回输前6 h予以hUC-MSC静脉输注，剂量2 U，细胞数1×107/单位，分别于移植后1 d、移植后2 d各输注供者造血干细胞，输注前给予碳酸氢钠、地塞米松、异丙嗪等药物处理，并应用抗炎、保肝、保护胃黏膜等药物治疗[6]。

（三）GVHD防治

自移植前7 d起给予环孢素A静脉滴注，每周检测血药浓度，确保环孢素A血药浓度维持在250 ng/ml左右，至胃肠道功能正常后改为口服，移植后180 d逐渐减量，移植后1年若未见GVHD发生即可停药。于移植前1 d口服霉酚酸酯，每日1次，每次1 g，持续至移植后30 ～ 40 d停药。根据Gluck Sberg H标准[7]，发现急性GVHD者，立即给予甲泼尼龙口服治疗，每日1次，每次1 ～ 2 mg/kg，起效后逐渐减量并改为强的松口服；若无效则停用环孢素A，加用他克莫司或CD25单抗治疗。发现慢性GVHD者，给予环孢素A联合强的松治疗。

三、观察指标

整理患儿造血重建情况、并发症发生情况以及随访结果，总结hi-HSCT联合hUC-MSC输注治疗儿童SAA的临床效果与安全性，造血重建情况观察中，白细胞植入时间以中性粒细胞＞0.5×109/L且持续3 d计，血小板植入时间以血小板＞20×109/ L计[8]；以短串连重复序列-聚合酶链式反应（short tandem repeats-polymerase chain reaction，STR-PCR）DNA指纹法，分别于移植后1个月、2个月、3个月及血象好转后检测干细胞植入情况，若供受者性别不同，加做染色体核型分析；若供受者血型不同，加做血型滴度检测[9]。

结 果

一、造血重建情况

11 例患儿输入 MNC（6.26 ～ 10.15）×108/kg，CD34（1.91 ～ 10.24）×106/kg，患儿全部获得造血重建，移植后1个月复查嵌合体均为70﹪～ 100﹪供者嵌合。白细胞植入时间8 ～ 21 d，中位时间为12 d；血小板植入时间10 ～ 24 d，中位时间为15 d。移植后1个月STR-PCR及染色体核型、血型检测均显示造血干细胞植入成功，HLA抗原为供者型，血型不合受者ABO血型转变为供者型。

二、并发症发生情况

11例患儿中，2例发生Ⅰ度急性GVHD，1例发生Ⅲ度急性GVHD，均经相关治疗后好转；1例发生局限性慢性GVHD，经相关治疗后好转；2例发生广泛性慢性GVHD，发生率为18.18﹪。

患儿移植期间均发生不同程度的恶心、呕吐、纳差和发热等症状，给予对症支持治疗后好转。8例（72.73﹪）发生口腔黏膜炎，2例（18.18﹪）发生肺部感染，9例（81.82﹪）发生病毒感染，2例（18.18﹪）发生腹泻，均经综合治疗后好转；1例患儿移植后1个月发生癫痫，停用环孢素A并改用他克莫司后症状未再发，随访期间病情稳定。

三、随访情况

11例患儿随访时间12 ～ 29个月，中位随访时间16个月，截止末次随访时1例因广泛性慢性GVHD接受持续治疗、2例接受免疫抑制剂减量治疗，其余4例均停用免疫抑制剂；1例患儿因家属自行停用环孢素A发生排异死亡（表1）。

讨 论

异基因造血干细胞移植是当前唯一可治愈SAA的手段，在缺乏合适的HLA全相合供者时，通过hi-HSCT，对于扩大干细胞来源有着重要意义，可为SAA患儿提供生存机会[10]。近年来，越来越多的学者开始关注hi-HSCT在SAA治疗中的应用，目前临床广泛应用的非体外去除T细胞骨髓和外周血混合移植模式，已替代了既往体外去除T细胞模式，在干细胞植入剂量、植入成功率、抑制性T细胞数量方面也发挥了巨大优势[11]。同时，为促进植入、预防感染，hUC-MSC输注的应用也愈发广泛。

当前hUC-MSC在成人SAA患者治疗中的安全性与有效性已得到证实[12]，但关于儿童SAA治疗的安全性仍有待大规模研究予以明确。此次研究11例患儿接受hi-HSCT联合hUC-MSC输注，其造血重建成功率达到100﹪，且广泛性慢性GVHD发生率仅为18.18﹪，显现出该方案在确保移植成功率、降低并发症发生风险方面的明显优势。SAA的发生发展与造血干细胞及造血微环境的改变有关，与单纯外周血干细胞移植相比，骨髓中间充质干细胞更为丰富[13]，而hUC-MSC比来源于骨髓的间充质干细胞分化能力更强，且hUC-MSC具有来源广泛、分离扩增简便、污染少、免疫源性低等特点，被认为是更理想的第三方细胞来源[14]。得益于hUC- MSC的低免疫原特性、多向分化潜能、造血支持和分泌多种生长因子促进干细胞植入、免疫调控、自我复制等特点[15]，患儿生存质量与预后质量均可得到明显改善。

表1 11例SAA患儿临床资料分析

作为供体移植物中T细胞对受体组织免疫攻击所引发的移植后并发症，GVHD可对患儿预后及长期生存质量造成严重影响，因此，GVHD的预防是SAA治疗中需要重点关注的环节[16]。考虑到患儿年龄较小，为避免第二肿瘤的发生，本例采用非照射方案予以预防，选用经典环磷酰胺、抗人T淋巴细胞免疫球蛋白方案的基础上，旨在预防GVHD的发生[17]。除此之外，对于合并骨髓灶性增生活跃的患儿而言，加用Bu以发挥清髓作用，对于保障患儿平稳度过预处理期、避免严重毒性反应甚至预处理相关死亡至关重要[18]。

需要注意的是，虽然11例患儿GVHD发生率得到了有效控制，但患儿口腔黏膜炎、病毒感染等移植相关并发症发生率仍处于较高水平，甚至可能是导致患儿无诱因性血象下降、死亡的原因。因此，在今后的临床实践中，移植前应完善普外、耳鼻喉、皮肤、眼科、口腔全面检查，清除全身感染灶；预处理时应给予保护肝肾、心脏等药物治疗，并注重尿液的碱化、水化，必要时给予美司钠以预防出血性膀胱炎；移植后可给予更昔洛韦预防巨细胞病毒感染的发生，同时，对于持续发热超过38 ℃的患儿，需给予经验性广谱抗生素治疗，待药敏结果得出后调整敏感抗生素，以期尽快控制感染，保证移植效果与患儿生存率。

综上所述，hi-HSCT联合hUC-MSC输注治疗儿童SAA的临床效果与安全性值得肯定，强调围移植期的体质评估、谨慎选择预处理方案、积极处理移植后相关并发症，对于确保移植成功率、提高治疗效果、改善患儿预后质量有着重要意义，应予以重点关注。

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