支架材料对棕色脂肪源性干细胞向起搏细胞诱导分化的影响

姬瑞娟 乔梁 黄超 陈磊 李玉泉 杨向群

生物起搏器可避免电子心脏起搏器伴随的诸如易感染、易受电磁干扰、电极脱位、再次手术更换电池等所致的并发症[1]，是未来取代传统方法治疗各型心律失常，以及细胞移植治疗失败的必然选择和发展方向[2]。目前，构建生物起搏器的方法包括基因转染[3]、细胞移植[4]、组织工程[5]等。其中，构建组织工程化起搏器的首要条件是找到理想的种子细胞，如人诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cells， hiPSC）[6]，心脏祖细胞[7]等，但是这些细胞具有潜在的致瘤性，以及获得困难的不足[8]。Yamada等[9]最早从小鼠棕色脂肪组织中分离出CD29+的干细胞，在常规培养条件下，得到了部分自发跳动的心肌样细胞。本实验室对上述细胞开展了进一步的研究，明确了只有棕色脂肪来源干细胞（brown adipose-derived stem cells， BADSCs）才能分化为自发跳动的心肌细胞，常规培养条件下自发分化的效率为5﹪ ～ 10﹪左右[10]，并从起搏细胞形态结构、特征蛋白表达、电生理特征及药理学实验等多个方面证实了部分细胞具有起搏细胞的特征[11]。BADSCs有希望成为理想的生物起搏器的种子细胞，但其在三维支架材料中的生长、分化情况尚不清楚。

胶原海绵、明胶海绵和水凝胶等多孔材料是组织工程中广泛应用的支架材料。因此，本研究设想将BADSCs移植到上述材料中，观察三种材料的生物相容性，以及BADSCs在三维支架材料中向起搏样细胞分化的情况，为体外构建生物起搏器提供依据。

材料和方法

一、材料

1.实验动物：C57BL/6小鼠 30只，出生 4 ～5 周，体重15 g左右。购自第二军医大学实验动物中心。所有动物实验均遵循第二军医大学动物饲养和管理委员会制订的实验动物使用规定（SYXK-2002-042）。

2.主要试剂：胎牛血清（美国Gibco公司），Ⅱ型胶原蛋白酶（美国Sigma公司），牛血清白蛋白（美国MP公司），HCN4、Sr、Cx45、HCN2（英国 Abcam公司），胶原海绵（无锡贝迪生物工程有限公司）、明胶海绵（无锡贝迪生物工程有限公司）、水凝胶（美国Glycosan BioSystems公司）。

二、方法

（一） BADSCs的分离、培养和鉴定

C57BL/6 小鼠，4 ～ 5 周，颈椎脱臼处死，用 70﹪酒精浸泡消毒，无菌条件下行BADSCs的分离培养，原代细胞利用流式细胞分析，原代棕色脂肪源性干细胞（＞ 106/ml），离心，PBS 吹悬，分装，分别加入抗小鼠 CD34、CD45、CD90、CD29（1 : 100 CD34、CD45、CD90、CD29）直标单克隆抗体，4 ℃避光孵育30 min，同时设立空白同型对照，550×g离心5 min，弃上清液，PBS洗涤2遍，PBS重悬，上机测试和油红O染色鉴定成脂，Alcian Blue 染色后经普鲁士蓝对比染色鉴定成软骨及茜素红染色鉴定成骨分化能力。

（二）细胞-支架复合体的构建和体外培养

消化培养7 d的原代BADSCs，调至细胞密度为（1.0 ～ 2.0）×106个 /ml，种植于 0.3 cm× 0.3 cm×0.3 cm 大小胶原海绵或明胶海绵中，加适量培养基，37 ℃，5﹪CO2培养箱中培养。配制透明质酸水凝胶（方法按产品说明书ES.BIO，number : GS314）与BADSCs混合，完成凝胶化后加入适量培养基置于37 ℃，5﹪CO2培养箱中常规培养。隔天换液，拍照观察。

（三） LIVE/DEAD检测

按 照 LIVE/DEAD试 剂 盒 说 明 书（Life，lot:1558755）分别检测（二）中构建的支架材料-细胞复合体3、7 d时细胞生长存活状况。激光共聚焦显微镜下观察绿色荧光标记的细胞为活细胞，红色荧光标记的细胞为死细胞。每组随机选取9个不同的视野，计算死细胞率，进行统计学分析。

（四） HE染色

取2周的细胞-支架复合体，冰冻切片，厚6 μm，4﹪多聚甲醛固定 8 min，PBS 洗 5 min×3 次，苏木精浸染10 min，自来水洗约20 min，75﹪盐酸乙醇分化1 ～ 2 s，温水返蓝约30 min，蒸馏水洗5 min，伊红10 s，自来水冲洗 30 min，自然晾干，二甲苯透明10 ～ 15 min，中性树胶封片。

（五）扫描电镜观察

取出培养2周的细胞-支架复合体，2.5﹪戊二醛固定过夜，扫描电镜下拍照。

（六）免疫荧光染色

2周的细胞-支架复合体，冰冻切片，厚6 μm，4﹪多聚甲醛固定8 min。行Connexin45、HCN4、HCN2和Sr免疫荧光染色，方法详见参考文献[11]。激光共聚焦显微镜（德国Leica公司）观察、拍照。所得照片采用软件LAS AF Lite导出。三种细胞-支架复合体切片用不同抗体处理后，每组随机选取9个不同的视野，计算细胞阳性率，进行统计学分析。

三、统计学分析方法

利用Graph Pad prism5.0软件，细胞接种到3种材料上3 d时，单倍视野下死细胞率以及培养2周时，Connexin45、HCN2、HCN4和Sr的细胞阳性率数据用± s进行表示，组间分析采用单因素方差分析，以P＜ 0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、BADSCs表达间充质干细胞表面标志并具有多向分化潜能

原代培养BADSCs 3 d时，相差显微镜下，可见贴壁细胞有多种形态：圆形、梭形及多角形等；7 d时，部分细胞已分化为细长肌管状及小圆形细胞，这些肌管状和小圆形细胞可自发颤动和不规则收缩；14 d时，肌管状细胞进一步变细变长并交织成网，开始搏动，搏动细胞从外观上相比其他细胞呈细长肌管样（图1）。流式细胞技术检测显示造血干细胞表面抗原CD34和CD45表达呈阴性，间充质干细胞表面抗原CD90，CD29呈阳性（图2）。成脂诱导7 d结束时，油红O染色脂滴呈鲜红色，成软骨诱导分化后，Alcian Blue 染色，可见成软骨细胞聚集成小的细胞团块，经普鲁士蓝对比染色后，团块中央有Alcian Blue染色阳性物质,为蓝色，证实有软骨特异性基质硫酸蛋白聚糖产生，成骨诱导第21天后，茜素红染色可见着橘红色的典型钙化结节（图3）。

二、支架复合体中BADSCs的生长增殖

利用LIVE/DEAD试剂盒分别于第3、7天检测BADSCs在3种支架材料中的存活和凋亡。第3天，明胶海绵和胶原海绵中红色代表的死细胞较多，水凝胶中有少量细胞死亡。第7天细胞密度均已大于第3天的细胞密度；且3组中凋亡死细胞均减少，甚至在水凝胶材料中看不到死细胞（图4a）。水凝胶中的细胞死亡率（1.76±1.08）﹪低于胶原海绵（46.35±1.50）﹪和明胶海绵（47.00±1.60）﹪，3组间比较差异具有统计学意义（F= 37.56，P＜ 0.05）。

三、支架复合体中BADSCs的形态学改变

CM-DIL标记的细胞在胶原海绵和明胶海绵支架中的形态呈现细长、多角及圆形（图5）。细胞-水凝胶复合体内可见小圆形的细胞连接成片搏动，同时带动水凝胶支架多个区域呈现不同频率的搏动，搏动频率在70 ～ 150次/min，而其他两组均未出现博动或局部区域搏动现象。HE染色结果，细胞并非均匀分布于胶原海绵、明胶海绵支架各部，而是多沿支架边缘、表面生长分布，中央区域细胞较少，但在水凝胶内细胞分布相对均匀（图6）。扫描电镜下可见，细胞-胶原海绵复合体表面已被大量细胞覆盖包裹成“蚕蛹”状；且细胞与细胞之间形成连接，呈现出整个立体的细胞层，无法观察到支架本身的表面结构。明胶海绵中，细胞的生长增殖少于胶原海绵组，但也有大量细胞附着于支架表面。水凝胶中细胞则多生长在凝胶内部，并未向支架表面延伸（图7）。

图1 倒置相差显微镜下观察分离培养的原代BADSCs（×200）

图2 流式细胞分析BADSCs的表面标志

图3 光学显微镜下观察BADSCs成脂，成软骨，成骨分化结果（×200）

四、起搏及心肌细胞相关特异蛋白在BADSCs的表达

通过检测2周复合体内细胞的起搏及心肌细胞相关特异基因的表达，发现经过一段时间的培养，三种支架中的BADSCs均已部分表达起搏细胞相关蛋白 Cx45、HCN2、HCN4、Sr（图 8a）。但是，细胞阳性率统计学分析显示，水凝胶中BADSCs的Connex45、HCN2、HCN4和Sr阳性表达率均高于其他组（P＜ 0.05）（表 1），说明水凝胶诱导 BADSCs表达起搏细胞基因效果更好。

图4 激光共聚焦显微镜下观察支架中的棕色脂肪来源干细胞（LIVE-DEAD染色， bar = 250 µm）

图5 荧光显微镜下观察棕色脂肪来源干细胞在支架中的生长形态（CM-DIL标记，×200）

图6 光学显微镜下观察2周细胞-支架复合体中细胞分布（HE染色，×400）

表1 单个视野下三组支架材料中阳性细胞比较（﹪， ± s ）

表1 单个视野下三组支架材料中阳性细胞比较（﹪， ± s ）

注：与胶原海绵组比较，aP ＜ 0.05 ，与明胶海绵组比较，bP ＜ 0.05

分组 视野数 Connexin45 HCN2 HCN4 Sr胶原海绵组 9 10.67±1.25 11.00±1.60 18.67±2.05 13.00±1.63明胶海绵组 9 13.67±1.25 14.00±2.16 13.00±1.60 14.33±1.24水凝胶组 9 21.00±1.60ab 34.33±3.68ab 66.00±2.94ab 75.33±3.30ab F值 9.435 17.52 27.96 36.40 P 值 ＜ 0.01 ＜ 0.01 ＜ 0.01 ＜ 0.01

图7 扫描电镜下观察2周细胞-支架复合体中细胞形态（bar = 200 µm）

讨 论

早期的研究结果，BADSCs在15﹪胎牛血清高糖DMEM培养基中，可以初步分化为起搏样细胞，但其三维环境下是否能继续分化尚不得而知。本研究将培养7 d后的原代BADSCs接种于胶原海绵、明胶海绵及透明质酸水凝胶中，结果表明细胞在3种材料中均能生长、存活，表达起搏细胞相关标志Connex45、HCN2、HCN4，表明其可以向起搏细胞进一步分化，为体外构建生物起搏器提供了可能。

本研究选取的胶原海绵以纯度高、生物活性高的牛Ⅰ型胶原为主要成分，临床上被用于止血和伤口愈合。相关研究表明软骨细胞、心肌细胞在胶原海绵三维支架中能够保持良好的生长、分化[12-14]。明胶是变性的胶原，其制成的多孔材料-明胶海绵，用于组织修复及创伤止血[15]。本研究中，细胞以这两种材料为支架载体能够在其表面和内部生长、增殖，但多分布于支架的边缘，而中央区域较少。可能是随着培养时间的延长，细胞进入对数增长期，细胞数量增加，支架材料中央难以提供充足的营养，细胞会向边缘迁移。透明质酸为一种广泛分布于多种组织的细胞外基质中的线性黏多糖[16]。以透明质酸为主要成分的水凝胶已被广泛应用于细胞三维培养、组织工程和再生医学领域[17]。同时，心肌中的透明质酸含量丰富。实验结果显示BADSCs在透明质酸水凝胶中能够很好地生长、增殖，而且分布比较均匀。LIVE/DEAD检测结果表明，水凝胶微环境更利于BADSCs的生长增殖。

图8 激光共聚焦显微镜下观察2周细胞-支架复合体中BADSCs的起搏基因表达（免疫荧光染色，bar = 25µm）

免疫荧光结果显示透明质酸水凝胶促进BADSCs分化表达起搏细胞蛋白的效果较胶原海绵和明胶海绵更显著。这与报道的基于透明质酸水凝胶的三维培养基质，可以支持干细胞的增殖、迁移及分化等相符[18]。特别值得注意的是，细胞-水凝胶复合体在培养14 d时出现搏动现象，至少持续56 d，直到人为地终止此种现象。但是，其他两组一直未见细胞-支架复合体发生搏动。至于为何相同现象并未发生在胶原海绵和明胶海绵上，可能与水凝胶接近正常心脏刚度且分布其中的搏动细胞更接近成熟起搏样心肌细胞有关，有关机制尚需进一步的探讨。

综上所述，胶原海绵、明胶海绵和透明质酸水凝胶均能促进BADSCs增殖、分化，而水凝胶微环境对BADSCs的损伤最小，且只有细胞-水凝胶支架可产生搏动，提示水凝胶更适用于组织工程化心脏起搏器的构建。

1 Ohlow MA, Lauer B, Brunelli M, et al.Incidence and predictors of pericardial effusion after permanent heart rhythm device implantation:prospective evaluation of 968 consecutive patients[J].Circ J, 2013,77(4):975-981.

2 Protze SI, Liu J, Nussinovitch U, et al.Sinoatrial node cardiomyocytes derived from human pluripotent cells function as a biological pacemaker[J].Nat Biotechnol, 2017, 35(1):56-68.

3 Ishikawa K, Tilemann L, Ladage D, et al.Cardiac gene therapy in large animals: bridge from bench to bedside[J].Gene Ther, 2012, 19(6):670-677.

4 Jun C, Zhihui Z, Lu W, et al.Canine bone marrow mesenchymal stromal cells with lentiviral mHCN4 gene transfer create cardiac pacemakers[J].Cytotherapy, 2012, 14(5):529-539.

5 Choi YH, Stamm C, Hammer PE, et al.Cardiac conduction through engineered tissue[J].Am J Pathol, 2006, 169(1):72-85.

6 Schweizer PA, Darche FF, Ullrich ND, et al.Subtype-specif i c differentiation of cardiac pacemaker cell clusters from human induced pluripotent stem cells [J].Stem Cell Res Ther, 2017, 8(1):229.

7 Zhang L, Li X, Yu X, et al.Construction of vascularized pacemaker tissues by seeding cardiac progenitor cells and endothelial progenitor cells into Matrigel[J].Life Sci, 2017, 179:139-146.

8 张喜, 李晓童.让生物起搏梦想照进现实-再建心脏房室传导的策略思考[J].第二军医大学学报, 2017, 38(7):821-827.

9 Yamada Y, Wang XD, Yokoyama S, et al.Cardiac progenitor cells in brown adipose tissue repaired damaged myocardium[J].Biochem Biophys Res Commun, 2006, 342(2):662-670.

10 陈磊, 姬瑞娟, 邓子军, 等.阻断经典Wnt通路对棕色脂肪干细胞向起搏样细胞分化的作用[J].解剖学杂志, 2015, 38(2):133-136.

11 Chen L, Deng ZJ, Zhou JS, et al.Tbx18-dependent differentiation of brown adipose tissue-derived stem cells toward cardiac pacemaker cells[J].Mol Cell Biochem, 2017, 433(1/2):61-77.

12 Radisic M, Park H, Shing H, et al.Functional assembly of engineered myocardium by electrical stimulation of cardiac myocytes cultured on scaffolds[J].Proc Natl Acad Sci U S A, 2004, 101(52):18129-18134.

13 Ponticiello MS, Schinagl RM, Kadiyala S, et al.Gelatin-based resorbable sponge as a carrier matrix for human mesenchymal stem cells in cartilage regeneration therapy[J].J Biomed Mater Res, 2000,52(2):246-255.

14 Kutschka I, Chen IY, Kofidis T, et al.Collagen matrices enhance survival of transplanted cardiomyoblasts and contribute to functional improvement of ischemic rat hearts[J].Circulation, 2006, 114(1 Suppl):I167-I173.

15 O'keefe RJ, Mao J.Bone tissue engineering and regeneration: from discovery to the clinic-an overview[J].Tissue Eng Part B Rev, 2011,17(6):389-392.

16 Xu X, Jha AK, Harrington DA, et al.Hyaluronic Acid-Based hydrogels: from a natural polysaccharide to complex networks[J].Soft Matter, 2012, 8(12):3280-3294.

17 Prestwich GD.Hyaluronic acid-based clinical biomaterials derived for cell and molecule delivery in regenerative medicine[J].J Control Release, 2011, 155(2):193-199.

18 Lawyer T, Mcintosh K, Clavijo C, et al.Formulation changes affect material properties and cell behavior in HA-Based hydrogels[J].Int J Cell Biol, 2012:737421.