糜子Ty1-copia型反转录转座子基因的序列特征及表达分析

何杰丽，薛延桃，王瑞云,*，陈国荣，陈凌，王海岗，杨美红*，乔治军*

(1.山西农业大学 文理学院，山西 太谷 030801；2.山西农业大学 农学院，山西 太谷 030801；3.山西省农业科学院 农作物品种资源研究所/农业部黄土高原作物基因资源与种质创制重点实验室/杂粮种质资源发掘与遗传改良山西省重点实验室，山西 太原 030031)

糜子(PanicummiliaceumL.)，属禾本科黍属，抗逆性强，是干旱半干旱地区主粮作物[1、2]。反转录转座子是植物基因组中普遍存在的一类遗传因子，以DNA-RNA-DNA的转座机制在植物基因组中移动，从而影响基因组变化和基因表达[3]。根据功能不同植物中反转录转座子包括两大类，长末端重复序列(LTRs，long terminal repeats)和非长末端重复序列(non-LTRs，no-long terminal repeats)[4]。Non-LTR包括PLE类型(PLE)、DIRS类型(DIRS)、短散布重复序列(SINE，short interspersed repetitive element)以及长散布重复序列(LINE，long interspersed repetitive element)[5]；LTR包括Ty1-copia和Ty3-gypsy两种类型[6]，含3个基因，分别为聚合酶基因(pol)、特异抗原基因(gag)、整合酶基因(int)。Ty1-copia和Ty3-gypsy两类反转录转座子结构和功能相似，主要区别为pol基因区域中INT基因插入的位置不同。一般情况下反转录转座子由于缺失、移框和终止子等原因，不能形成反转录转座子蛋白，不具生物学活性，呈静止状态。病毒、细菌、真菌病原接种[7～9]以及水杨酸、茉莉酸甲酯[10]等生物和非生物胁迫后，不活跃的LTR在植物受到转录激活。在生物和非生物胁迫下，植物反转录转座子被激活以参与调节抗逆相关基因表达，反转录转座的发生可能与植物自我防卫反应有关，是植物保护自我的反应机制[11]。

糜子中参与干旱胁迫应答的相关基因有很多[12～14]，但关于糜子Ty1-copia基因是否参与干旱胁迫应答、其表达特性如何尚未见报道。本研究利用生物信息学软件预测了Ty1-copia编码蛋白的生化特性，用qRT-PCR对其在植株叶片不同胁迫时间处理后目标基因的表达水平做了分析。旨在为利用Ty1-copia基因改良作物抗旱性及分子育种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为黄糜子(00005272)，由山西省农业科学院农作物品种资源研究所提供。前期转录组测序发现糜子cDNA文库中的一段DNA序列，根据Swissprot、nr、nt三个数据库注释可知该序列所编码的蛋白是反转录转座子蛋白。该基因表达分析的材料培养方法同王瑞云[12]，利用20% PEG-6000蒸馏水溶液进行干旱胁迫处理，分别于处理后0、3、6和8 h取样。

1.2 Ty1-copia型反转录转座子基因编码蛋白的生物信息学分析

在NCBI中，用ORF Finder在线软件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ projects/gorf/)预测开放阅读框并翻译蛋白质序列；用ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)在线分析软件预测蛋白质的理化性质；用SignalP2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)在线分析软件对蛋白进行信号肽预测；用YinOYang 1.2(http://www.cbs.dtu.dk/services/)在线软件预测蛋白的葡萄糖-O糖基化位点；用NetNES(http://www.cbs.dtu.dk)在线软件分析该蛋白有无核输出信号；用TargetP(http://www. cbs.dtu.dk /services/TargetP)、ChloroP(http:// www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP)在线软件对该蛋白进行亚细胞定位预测；用Phyre2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html)在线程序对反转录转座子蛋白进行二级结构和三级结构的预测；用TMHMM-2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)在线软件对该蛋白的跨膜螺旋结构进行预测；用DNAMAN(version 8.0) 和MEGA(version 7.0.21进行序列多重比较并构建系统进化树；用MEME在线软件(http://meme-suite.org/)预测反转录转座子蛋白的保守结构。

1.3 Ty1-copia型反转录转座子基因的实时荧光定量表达分析

采用TRIzon总RNA提取试剂盒(CW0580S)提取叶片总黄糜子叶片RNA，并通过1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。采用PrimeScript© RT Master Mix试剂盒(TaKaRa，大连)反转录合成第一链cDNA，保存于-20 ℃ 冰箱。用Primer5软件设计特异引物(F：5'- CTCAGTCAGCGAGGTTAT -3'，R：5'-ACGAGAACAGACCATAGC-3')与内参引物ACT(F：ACCGAAGCCCCTCTTAACCC，R：5'-GTATGGCTGACACCATCACC-3')[15]并由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

以 cDNA为模板进行实时荧光定量PCR 扩增，反应体系为10 μL，包括模板(糜子cDNA)1 μL，SYBR Premix EX Taq II (Tli RnaseH Plus)(2×) 5 μL，50×ROX 0.2 μL，前后引物(10 μmol·L-1)各0.4 μL，ddH2O 3 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性10 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸1 min，39个循环；反应结束后确认实时定量PCR的扩增曲线和熔解曲线，利用2-△△CT法[16]计算基因在不同样品中的相对表达量。不同样品间差异显著性用DPS软件中的one-way ANOVA中的Duncan多重比较进行统计分析每个样品3次生物学重复，3次技术重复。

2 结果与分析

2.1 序列分析

Ty1-copia型反转录转座子蛋白的cDNA序列包含285 bp的完整开放阅读框，编码94个氨基酸，5’端有一个起始密码子ATG，编码甲硫氨酸(M)，3’端有一个终止密码子ATT，不编码氨基酸(图1)。该蛋白的理化性质(表1)，是由19种氨基酸组成(色氨酸含量为0)，其中亮氨酸(L)和丝氨酸(S)含量较高，分别为10.6%和11.7%；谷氨酰胺(Q)、组氨酸(H)和苏氨酸(T)3种氨基酸含量较少，均为1.1%；带8个负电荷氨基酸，带12个正电荷氨基酸，说明该蛋白总体呈弱碱性；不稳定系数、总平均亲水性、脂肪系数说明该蛋白是不稳定的疏水蛋白。

表1 Ty1-copia蛋白的理化性质Table 1 Physicochemical properties of Ty1-copia protein

图1 Ty1-copia型反转录转座子蛋白的核苷酸和预测的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and predicted amino acid sequences of Ty1-copia type retrotransposon protein

2.2 信号肽预测

SignalP2.0在线软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预测Ty1-copia型反转录转座子蛋白信号肽序列，结果显示信号肽可能性为0.00，信号锚序列可能性为0.049，最大切割位点可能性为0.00(图2)，说明该蛋白无信号肽，可能是非分泌型蛋白，在细胞膜内表达。

图2 Ty1-copia型反转录转座子蛋白的信号肽预测Fig.2 Signal peptide prediction of Ty1-copia type retrotransposon protein

2.3 葡萄糖-O糖基化位点的预测

YinOYang 1.2在线软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/)预测Ty1-copia型反转录转座子蛋白的葡萄糖-O糖基化位点，结果显示该蛋白有四个葡萄糖-O-糖基化位点，分别为48位的丝氨酸(S)、78位的丝氨酸(S)、93位的丝氨酸(S)和94位的丝氨酸(S)，其中48位和78位的丝氨酸是葡萄糖-O糖基化位点的可能性较大(图3)。糖基化位点与细胞的信号通路有着密切联系，所以进一步说明该蛋白在细胞内表达。

图3 Ty1-copia型反转录转座子蛋白的葡萄糖-O-糖基化位点预测Fig.3 Glucose-O-glycosylation site prediction of Ty1-copia type retrotransposon protein

2.4 核输出信号分析

NetNES(http://www.cbs.dtu.dk)在线软件分析Ty1-copia型反转录转座子蛋白有无核输出信号，结果显示该蛋白质的第13位的缬氨酸(V)和第15位的异亮氨酸(I)的NES-Score均超过阈值(图4)，该氨基酸即为反转录转座子蛋白的核输出信号，表明该蛋白质定位于细胞质。

图4 Ty1-copia型反转录转座子蛋白的核定位信号预测Fig.4 Nuclear localization signal prediction of Ty1-copia type retrotransposon protein

2.5 亚细胞定位

ChloroP(http:// www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP)和TargetP(http://www. cbs.dtu.dk /services/TargetP)在线软件对Ty1-copia型反转录转座子蛋白进行亚细胞定位，结果显示该蛋白叶绿体靶向肽(cTP)值为0.439，mTP(线粒体靶向肽)值为0.185(图5)，cTP和mTP值均太低，说明该蛋白质不能定位于叶绿体和线粒体上。

图5 Ty1-copia型反转录转座子蛋白的亚细胞定位Fig.5 Subcellular localization of Ty1-copia type retrotransposon protein

2.6 跨膜螺旋预测

TMHMM-2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)在线软件对Ty1-copia型反转录转座子蛋白的跨膜螺旋结构预测结果显示，该蛋白无跨膜螺旋结构(图6)；有一段跨膜肽链(46位氨基酸到63位氨基酸的肽链)，且N-末端在膜外，C-末端在膜内(图7)。

图6 Ty1-copia型反转录转座子蛋白的跨膜螺旋结构预测Fig.6 Transmembrane helix structure prediction of Ty1-copia type retrotransposon protein

图7 Ty1-copia型反转录转座子蛋白的跨膜肽链Fig.7 Transmembrane peptide chain of Ty1-copia type retrotransposon

2.7 蛋白结构预测

Phyre2在线程序(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html)预测Ty1-copia型反转录转座子蛋白的二级结构和三级结构，结果显示该蛋白包含4个α螺旋和4个β折叠，α螺旋占38%，β 折叠占31%(图8)，α螺旋的区域明显大于β折叠的区域，说明α螺旋是该蛋白的大量结构元件；三维结构中红色表示N端，蓝色表示C端，其中有一个明显的螺旋结构和两个明显的折叠结构(图9)。

2.8 保守结构域的预测

MEME(http://meme-suite.org/)在线软件预测Ty1-copia型反转录转座子蛋白的保守结构域，结果显示该蛋白有4个保守结构域，分别是3至8位的5’-NLGAAK-3’、28至33位的5’-QRGYIE-3’、40至45位的5’-NMHDAK-3‘以及81至86位的5’-VDCLMY-3’(图10)。在与水稻、毛竹、辣椒等其他8种作物的多重序列比对中也找到了相关的保守结构(图11)。

图8 Ty1-copia型反转录转座子蛋白的二级结构Fig.8 Secondary structure of Ty1-copia type retrotransposon protein

图9 Ty1-copia型反转录转座子蛋白的三级结构Fig.9 Tertiary structure of Ty1-copia type retrotransposon protein

图10 Ty1-copia型反转录转座子蛋白的保守结构域预测Fig.10 Conservative domain prediction of Ty1-copia type retrotransposon protein

2.9 多重序列比对以及系统进化树构建

用DNAMAN(version 8.0) 软件对该蛋白的同源序列进行多重序列比对并构建系统进化树(图11、12)。多重序列比对结果显示各个物种Ty1-copia型反转录转座子蛋白的氨基酸差异较大，相似性只有24.9%，说明该蛋白的保守性不强，在进化过程中发生突变的可能性较大。进化树结果显示糜子的Ty1-copia型反转录转座子蛋白与稻属(粳稻、野生稻、药用稻)和毛竹序列一致性为64%。

图11 9种植物Ty1-copia型反转录转座子蛋白的氨基酸多重序列比对Fig.11 Amino acid multiple sequence comparison of Ty1 - copia type retroviruses of nine plants注：* 表示保守结构。Note: * represents a conservative structure.

图12 9种植物Ty1-copia型反转录转座子蛋白的进化树Fig.12 Evolutionary tree of Ty1-copia type retrotransposon protein of 9 species

2.10 糜子Ty1-copia型反转录转座子基因的表达特性分析

qRT-PCR 分析表明，Ty1-copia表达水平在干旱胁迫处理不同时间点存在显著差异(表2)。3 h时表达量最高，为对照的2.02倍；8 h时该基因呈下调表达，表达量低于对照，说明该基因可以响应干旱胁迫诱导。

3 讨论与结论

植物抗逆反应是植物的一种自我保护，该过程是比较复杂的调控网络，Ty1-copia基因编码转录转座子蛋白在该网络中发挥着至关重要的作用。Ty1-copia基因编码蛋白在某些生物和非生物胁迫下表达，从而激活植物抗逆相关基因表达，提高植物的抗逆性[17]。根据Tnt1[7]和Tto1[18]以及OARE-1[11]通过物理(紫外照射和伤害)以及化学(尤其是水杨酸)胁迫被激活，发现Ty1-copia基因的表达和植物的抗逆性密切相关。我们用PEG模拟干旱胁迫，发现处理3 h时基因表达量是对照的2.02倍，8 h时则呈下调表达，说明Ty1-copia基因可能参与糜子的抗旱性响应。

表2 Ty1-copia 基因表达水平Table 2 Expression level of Ty1-copiagene

注：不同大小写字母分别表示差异极显著(P<0.01)和显著(P<0.05)。
Note: Different captial and lowercase letters indicate extremely remarkable and significant difference at 0.01 and 0.05 level, respectively.

江树业等[19]以籽粒苋为材料，克隆并研究了Ty1-copia反转录转座子在籽粒苋中的作用，结果表明在28条克隆序列中存在高度的异质性。周鹏等[20]以梨为材料研究结果类似，克隆的32条序列中也存在异质性，并且发现碱基的替换、缺失、易位导致的突变是其具有异质性的重要原因之一，说明了反转录转座子在进化过程中保守性不高。本研究也对Ty1-copia型反转录转座子蛋白进行了系统的序列特征分析，通过同源性比对，该基因属于RVT-2超家族成员，糜子Ty1-copia型反转录转座子蛋白与大部分单子叶植物聚为一类，相反，与双子叶植物的氨基酸的一致性较低，可见双子叶植物和单子叶植物在Ty1-copia型反转录转座子的遗传进化上存在较大差异，进化过程中保守性不高。

目前本实验室已对糜子种质资源的遗传多样性进行了初步评估[21～23]，后续研究将侧重于挖掘和克隆糜子抗旱相关基因，以期为抗旱性遗传改良提供靶标基因。

参 考 文 献

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