虫草素对MPTP诱导的小鼠多巴胺能神经元损伤的保护作用及其机制

樊逸云，唐培宸，顾欣霞，张 鑫，孙 莹，余伯成，张晓燕，葛晓群

(1. 扬州大学医学院药理学教研室，江苏 扬州 225001；2. 上海国宝企业发展中心，上海 201203)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一种中枢神经系统退行性疾病，其主要特征是中脑黑质致密部(substantia nigra pars compacta，SNpc)多巴胺(dopamine，DA)能神经元变性死亡，最终导致DA含量降低[1]。其发病机制十分复杂，与细胞凋亡关系密切[2]。目前，临床治疗的药物主要缓解患者症状，难以从根本上抑制DA能神经元的渐进性丢失[3]，因此，寻找能够阻止PD病程的神经保护剂意义重大。

虫草素(cordycepin，Cor)是从蛹虫草中分离的一种核苷类化合物，具有广泛的药理活性，然而，其对PD的影响报道甚少。Olatunji等[4]和本课题组[5-6]前期研究发现，Cor可抑制PD模型PC12细胞的损伤和凋亡。然而，Cor是通过何种信号转导通路介导了这一效应，以及能否在动物体内发挥对DA能神经元的保护作用，目前尚未见该方面的研究报道。

多条信号转导通路参与介导了PD黑质DA能神经元的凋亡[7]，其中，丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)信号转导通路发挥了重要作用。体外研究发现，激活JNK通路可引起DA神经元凋亡[8]，在PD患者脑组织中亦发现p38通路明显活化[9]，中脑黑质部有p-ERK1/2的积聚[10]。为此，本研究利用1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine，MPTP)制备PD小鼠模型，观察Cor对中脑黑质DA能神经元及MAPK信号通路的影响，以进一步探讨其神经保护作用及机制，为探索PD治疗新靶点提供依据，为Cor作为神经保护剂的临床应用提供实验基础。

1 材料

1.1实验动物50只C57BL/6小鼠，♂，体质量(20±2)g，购于扬州大学实验动物中心，实验动物生产许可证：SCXK(苏)2012-0004，使用许可证号：SYXK(苏)2012-0029。小鼠饲养于温度为(20±2)℃、相对湿度(60±10)% 的动物房，自由进食水，12 h/12 h光照周期。

1.2药物与试剂虫草素(纯度99%，上海国宝企业发展中心)；MPTP(东京化成工业株式会社)；DA、二羟苯乙酸(DOPAC)和 高香草酸(HVA)标准品(美国Sigma公司)；TUNEL法细胞凋亡检测试剂盒、HRP标记的二抗(博士德生物工程有限公司)；抗TH、p-p38、p-ERK1/2抗体(美国Abcam公司)；抗JNK1/2和p-JNK1/2抗体(上海生工生物工程有限公司)；抗Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3、p38、ERK1/2、GAPDH抗体(万类生物科技有限公司)；β-actin抗体(北京博奥森生物技术科技有限公司)。

1.3仪器大小鼠转棒疲劳测试仪、旷场实验箱、Super Maze+高通量动物行为实验分析系统(上海欣软信息科技有限公司)；Nikon80i正置显微镜(日本Nikon公司)；Multiskan FC型酶标仪(美国Thermo公司)；5415R型冷冻离心机(德国Eppendorf公司)；电泳仪(美国Bio-Rad公司)；Tanon 5200全自动化学发光成像系统(上海天能科技有限公司)。

2 方法

2.1实验分组及给药50只小鼠，随机分为5组，每组10只。分别为：正常对照组、模型组(MPTP组)、Cor低、中、高剂量组(2.5、5.0、10.0 mg·kg-1)。Cor用生理盐水溶解，给药剂量由预实验确定，灌胃给药。MPTP(30 mg·kg-1)溶于生理盐水，腹腔注射给药[11]。对照组d 1～15灌胃生理盐水，d 4～8注射生理盐水；模型组d 1～15灌胃生理盐水，d 4～8注射MPTP；Cor组d 1～15分别灌胃不同浓度Cor，d 4～8注射MPTP。末次给药结束后，d 2进行小鼠行为学检测。

2.2行为学检测

2.2.1旷场实验 实验前2 h，将小鼠从动物饲养室移至行为学检测实验室，让其适应实验室环境。实验开始时，将动物放于50 cm×50 cm × 25 cm的旷场内，让其自由活动10 min，记录小鼠的运动轨迹和运动距离。

2.2.2转棒实验 小鼠实验前训练3 d，疲劳转棒仪直径为3 cm，每只小鼠每天训练300 s。正式实验时转速设定300 s内，由4 r·min-1逐渐加速到40 r·min-1，记录小鼠从转轴上跌落的潜伏期。每只重复3次，每次间隔30 min，取平均值。

2.2.3爬杆实验 木杆长50 cm，直径1 cm，顶端固定有直径2.5 cm的木球，木杆缠纱布以防打滑，记录小鼠在球上停留的时间(T1),以及小鼠从小球底端爬到杆的底部所需要的时间(T2)。每只重复3次，每次间隔3 min，取平均值。

2.3HPLC-ECD法检测纹状体DA及其代谢产物含量行为学测定结束后，每组取6只小鼠，断头取脑，在冰上迅速取出同一侧纹状体称重，每1 mg组织加10 μL匀浆液，超声匀浆。于4℃、20 000 r·min-1离心20 min，取上清液，-80℃保存备用。HPLC-ECD检测纹状体组织中DA、DOPAC、HVA的含量。

2.4免疫组织化学法检测TH阳性细胞行为学测定结束后，每组取3只小鼠，麻醉后用4%多聚甲醛心脏灌流，断头取脑，放入4%的多聚甲醛中继续固定，之后常规石蜡包埋。根据小鼠脑立体定位图谱进行冠状连续切片，片厚4 μm，切片分组收集。采用免疫组化SABC法，在光镜下对SNpc区域观察并拍照，每只小鼠重复观察3张切片，用Image plus 6.0图像分析软件，选择有清晰细胞轮廓带有明显核仁的神经元进行计数，定量分析SNpc区域TH阳性细胞。

2.5TUNEL法检测细胞凋亡采用TUNEL法，按试剂盒方法操作。光镜下观察SNpc区域，每只小鼠重复观察3张切片，计数每张切片SNpc区5个高倍视野的阳性细胞，每只小鼠3张切片阳性细胞数的平均值为该只小鼠凋亡细胞数。

2.6Westernblot法检测相关蛋白的表达6只小鼠取出纹状体后，分离黑质组织，取其中3只小鼠的黑质组织,按比例加入新鲜配制的RIPA裂解液进行匀浆，4℃、10 000 r·min-1离心15 min，收集上清于-80℃保存备用。BCA法进行蛋白含量测定。以30 μg蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，转印，封闭，加入一抗(Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3、p38、p-p38、ERK 1/2、p-ERK 1/2、JNK 1/2、p-JNK 1/2)4℃过夜。TBST洗膜后，加入二抗4℃孵育4 h，洗膜后用ECL法显影，使用Image J软件进行灰度分析。

3 结果

3.1Cor对PD小鼠运动功能的影响

3.1.1旷场实验 旷场实验是目前评价小鼠运动功能和精神状态最常用的方法之一。与对照组相比，模型组小鼠的运动总路程明显减少(P<0.01)；与模型组相比，除低剂量外，中、高剂量Cor预处理后，小鼠的运动总路程均明显增加(P<0.01)，自发活动能力得以改善(Fig 1A)。

3.1.2转棒实验 转棒实验主要用来观察小鼠的肌张力和平衡协调能力。与对照组相比，模型组小鼠在滚筒上滞留的时间明显缩短(P<0.01)，且出现肌肉无力、不喜运动等现象，说明小鼠运动平衡功能受损严重；与模型组相比，Cor组小鼠的滞留时间有延长的趋势，中、高剂量Cor组效果明显(P<0.01)，一定程度提高了小鼠的肌张力及运动平衡能力(Fig 1B)。

3.1.3爬杆实验 爬杆实验是常用的评价MPTP模型小鼠动作迟缓的方法，爬杆动作需要姿势调整及平衡协调能力的共同参与。模型组小鼠在球上停留的时间(T1)和爬完全杆的时间(T2)均较对照组明显延长(P<0.01)。与模型组相比，不同剂量Cor干预后，T1均明显缩短(P<0.01)，T2与T1结果趋势相似，除Cor低剂量组差异无显著性，其余组均明显缩短(P<0.05，P<0.01)，改善了小鼠运动迟缓，提高了身体协调性(Fig 1C)。

Fig 1 Effects of cordycepin on motor functions of

A: The movement distance of mice in the open-field; B: The retention time of mice on the rotating rod; C: Pole test of mice.**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsMPTP

3.2Cor对PD小鼠纹状体DA及其代谢产物含量的影响与对照组比较，模型组小鼠纹状体内DA含量明显降低(P<0.01)，其代谢产物DOPAC、HVA含量也出现明显下降(P<0.01)。与模型组比较，各Cor组小鼠纹状体内DA、DOPAC、HVA含量均明显升高(P<0.05，P<0.01)，见Tab 1。

Tab 1 Effects of cordycepin on DA and its metabolitesin striatum of MPTP-induced mice n=6)

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsMPTP.

3.3Cor对PD小鼠黑质TH阳性细胞数的影响对照组小鼠SNpc区可见大量排列整齐的TH免疫阳性神经元，细胞饱满，呈梭形或锥体形，轴突和树突交织的网状结构清晰完整。与对照组相比，模型组小鼠SNpc区TH免疫阳性细胞明显减少(P<0.01)，神经元胞体皱缩，轴突和树突丢失严重；与模型组相比，Cor低、中、高剂量组小鼠SNpc区TH免疫阳性细胞丢失程度均明显减轻(P<0.01)，其中Cor低剂量组神经元皱缩情况有所改善，但轴突和树突丢失依然明显，Cor中、高剂量组神经元胞体较为饱满，轴突和树突的网状结构损伤不明显，以Cor高剂量组最为清晰完整(Fig 2、Tab 2)。

Tab 2 Effects of cordycepin on TH-immunoreactivecells and TUNEL-immunoreactive cells in SNpc of

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsMPTP

3.4Cor对PD小鼠黑质DA神经元凋亡的影响对照组仅见极少量的TUNEL染色阳性细胞，而模型组可见大量棕黄色TUNEL染色阳性细胞，细胞核皱缩，形态不规则。Cor干预后，各组TUNEL染色阳性细胞较模型组均明显减少(P<0.01)，见Fig 3、Tab 2。

3.5Cor对凋亡相关蛋白表达的影响如Fig 4所示，与对照组相比，MPTP模型小鼠SN中Bax和Cleaved caspase-3蛋白表达明显增加，Bcl-2蛋白表达和Bcl-2/Bax比值明显降低，且差异均具有显著性(P<0.01)；Cor干预后可以逆转上述现象，Bax和Cleaved caspase-3蛋白表达降低，Bcl-2蛋白表达和Bcl-2/Bax比值均升高，其中Cor中、高剂量组作用明显(P<0.01)。

Fig 2 Effects of cordycepin on TH-immunoreactive cells in SNpc of MPTP-induced mice (×100)

A: Control group; B: 30 mg·kg-1MPTP group; C: 2.5 mg·kg-1Cor+MPTP group; D: 5.0 mg·kg-1Cor +MPTP group; E: 10.0 mg·kg-1Cor+MPTP group.

Fig 3 Effects of cordycepin on apoptosis in SNpc of MPTP-induced mice (×400)

A: Control group; B: 30 mg·kg-1MPTP group; C: 2.5 mg·kg-1Cor +MPTP group; D: 5.0 mg·kg-1Cor +MPTP group; E: 10.0 mg·kg-1Cor+MPTP group.

3.6Cor对MAPK通路蛋白表达的影响如Fig 5所示，各组间p38、ERK1/2、JNK1/2蛋白表达均无明显变化。与对照组相比，模型组小鼠黑质中p-p38、p-ERK1/2及p-JNK1/2蛋白表达均明显增加(P<0.01)；与模型组相比，除Cor低剂量组p-p38和p-JNK表达无明显差异外，其他各组p-p38、p-ERK1/2、p-JNK1/2蛋白表达均明显减少(P<0.05，P<0.01)。

4 讨论

PD患者的临床症状以运动功能障碍为主，其原因是中脑SNpc区DA能神经元变性死亡，导致纹状体DA含量下降所致。本研究应用MPTP成功地模拟了上述变化，并观察到Cor能改善模型小鼠自主活动减少、运动迟缓和平衡协调能力下降的现象。同时，检测到小鼠SNpc区TH免疫阳性神经元丢失程度明显减轻，纹状体DA、DOPAC、HVA含量明显升高。有研究发现，爬杆实验结果与小鼠纹状体DA浓度高度相关[12]，这在本实验中也得到证实。上述结果表明Cor能够抑制MPTP-PD小鼠DA能神经元损伤，显示了较好的神经保护作用。这一结果目前尚未见文献报道。

PD的发病与细胞凋亡关系密切。在我们前期的体外实验中，通过Hoechst 33258核染色、Annexin V-FITC/PI双染和电镜实验发现，Cor可以抑制鱼藤酮(rotenone，Rot)诱导的PC12细胞凋亡[5]。本实验显示，模型组小鼠黑质区出现大量TUNEL染色阳性细胞，Cor可以明显减少其阳性细胞数量，提示Cor在体内、体外均可抑制DA能神经元凋亡。细胞凋亡过程受到一系列凋亡蛋白的控制，其中Bcl-2家族和caspase家族最具代表性。Bcl-2家族中抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax是细胞凋亡的主要作用蛋白，Bcl-2/Bax比率直接决定了细胞的存亡。caspase-3是caspase家族中最重要的凋亡执行者之一，它的活化能够启动凋亡级联反应。本实验显示，Cor可以逆转MPTP引起的Bcl-2表达降低，Bax表达增加和caspase-3的活化，提高Bcl-2/Bax比值，发挥抗凋亡作用。

在哺乳动物体内，MAPK信号转导通路参与了细胞增殖、分化、凋亡和应激等病理生理过程，主要包括由p38、ERK、JNK介导的3条途径。本研究发现，MPTP可以使小鼠黑质中p-p38、p-ERK1/2、p-JNK1/2蛋白表达明显增加。Cor预处理后抑制了MPTP导致的p38、ERK1/2、JNK1/2蛋白的磷酸化，使其表达明显减少。既往研究表明，JNK信号通路参与了线粒体介导的细胞凋亡，促进线粒体释放细胞色素C到胞质，激活caspase级联反应[8]，诱导DA能神经元凋亡。另一方面，p38活化后能通过Fas受体途径介导凋亡[13]。我们在Rot诱导的PC12细胞中发现，Cor能够明显提高线粒体膜电位，减少细胞色素C向胞质的释放，并能下调Fas蛋白的表达[13]，推测Cor可能是通过抑制p38和JNK1/2的磷酸化，经内源性和外源性途径抑制细胞凋亡的。自由基能够激活ERK1/2，诱发下游细胞信号分子Bax的表达[14]，并且可以启动caspase-3活化，导致DA能神经元变性丢失[15]。体外研究发现，Cor能提高PD细胞内超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶等抗氧化酶活性，降低细胞内活性氧和丙二醛水平[4,6]，据此推测Cor可能通过清除自由基，减弱氧化应激反应而抑制ERK1/2的激活，最终减少DA能神经元凋亡。当然，本研究只是初步结果，还有待进一步实验证实。氧化应激诱导神经细胞凋亡的分子机制十分复杂，其调控途径还包括NF-κB通路、p53通路、PI3K/Akt通路、Nrf2通路等信号通路，Cor是否参与了这些信号通路的调控，还有待进一步研究。

Fig 4 Effects of cordycepin on protein expressions of apoptosisrelated proteins in SN of MPTP-induced n=3)

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsMPTP

Fig 5 Effects of cordycepin on protein expressions ofMAPK signal in SN of MPTP-induced mice n=3)

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsMPTP

综上所述，Cor对MPTP诱导的小鼠DA能神经元损伤具有保护作用，其机制可能是通过抑制MAPK的磷酸化水平，下调Bax表达，上调Bcl-2表达，以及抑制caspase-3活化，最终抑制DA能神经元凋亡。

(致谢：本实验在扬州大学医学院大型实验仪器平台和药学实验中心完成，感谢课题组全体老师和同学给予的指导和帮助，同时也感谢南京医科大学江苏省神经退行性疾病重点实验室为DA含量测定提供的帮助和支持)

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