枣和酸枣杂交后代遗传多样性的SSR分析

闫芬芬，郑兴娟，罗 智，王玖瑞,3*，刘孟军*

(1.河北农业大学 中国枣研究中心，河北 保定 071001；2.河北农业大学 林学院，河北 保定 071001;3.河北省枣产业技术研究院,河北 保定 071001)

杂交育种可通过基因的分离和重组实现杂交后代群体的性状分离。杂交后代群体的遗传多样性和遗传倾向分析可为亲本选配、杂交后代性状预测及遗传改良提供理论依据[1-3]。近年来，在苹果、沙田柚等多种果树上均有关于杂交后代遗传多样性的报道[4-7],我国原产特色果树枣树(Ziziphusjujuba)也相继开展了实生杂交后代的遗传多样性分析[8-10]。由于枣树杂交育种面临花小去雄难、坐果率低和胚败育严重等难题，致使人工杂交育种很难获得杂交后代[11]，至今未见枣大规模人工杂交后代群体的遗传多样性和遗传倾向性分析。雄性不育种质具有生产无籽果实、免去雄等优势，在果树生产和育种上具有重要应用价值[12]。王玖瑞[13]等通过发现枣树雄性不育种质有效解决了枣树人工去雄的难题[13]，并成功应用于枣杂交后代群体的构建[14-16]。SSR(simple sequence repeat)标记多态性高、易检测、重复性好，SSR分析已成为揭示果树杂交后代群体遗传变异和遗传倾向性的有效手段。SSR标记在杂交后代鉴定[17-18]和遗传多样性分析方面已得到成功应用。本研究以枣树的雄性不育种质JMS2为母本，以枣树的野生种酸枣(Z.acidojujuba)的优系‘邢16’为父本，于2015年通过罩网控制授粉杂交[19-20]获得一批杂种，经在温室播种培养获得1年生杂交后代179株，进而利用SSR分子标记技术对该杂交后代群体进行了杂种鉴定和遗传分析，旨在揭示枣和酸枣杂交后代群体的遗传多样性和遗传倾向，为进一步开展枣和酸枣间杂交育种及杂交后代性状分离规律研究提供指导。

1 材料与方法

1.1 材料

以罩网控制授粉杂交获得的枣雄性不育‘JMS2’(Z.jujuba‘JMS2’)×酸枣‘邢16’(Z.acidojujuba‘Xing 16’)组合的179株1年生杂交后代及父母本为试材。于2016年8月初采集嫩叶，立即放入变色硅胶干燥处理，密封保存。杂交试验在新疆生产建设兵团第一师十团苗木中心进行，SSR分析在河北农业大学进行。

1.2 叶片DNA的提取

称取干燥叶片0.1～0.2 g，采用改良CTAB法[21]提取基因组总DNA，使用超微量分光光度计(Thermo Scientific NanoDrop 2000)检测样品DNA浓度和纯度，将样品浓度统一稀释至50 ng·μL-1，于-20℃保存备用。

1.3 PCR扩增及杂种鉴定

从课题组前期筛选出的多态性好的SSR引物中随机选取21对，对杂交群体进行PCR扩增，PCR反应产物在8%变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，经AgNO3溶液银染后，用甲醛溶液显色，并拍照[18]。所用SSR引物由本课题组基于枣基因组测序数据开发[21]，并委托上海生物工程公司合成，引物信息见表1。

表1 SSR引物信息Table 1 List of SSR primers used

1.4 杂交后代SSR遗传分析

将21对引物扩增出的条带进行记录，分别以“1”和“0”表示同一位置谱带的有无，利用NTSYS-2.10软件进行遗传距离和亲缘关系UPGMA聚类分析[22]。应用popgeny32软件对子代群体和分类组进行遗传参数分析[23]，分别计算不同基因位点的平均等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、Shannon信息指数(I)、期望杂合度(Hei)、遗传分化系数(Fst)和基因流(Nm)。

2 结果与分析

2.1 杂种鉴定

利用本课题组筛选出的‘JMS2’בXing16’双亲差异互补引物JSSR311[15]，对179个子代及父母本进行鉴定(图1)。可以看出，母本扩增出2个特异性条带，父本扩增出1个特异性条带，父母本的条带类型呈差异互补型。子代中均出现了父本的特异性条带，多数出现了1条母本的特性性条带，其中17和19号单株同时出现了母本的2个条带和父本的1个条带，表明所有子代均为真实杂交后代。表明引物JSSR311可一次扩增出3个多态性位点，可一次性鉴定出全部杂交后代，具有高效、快速、一次性大量鉴定杂种的特点，在杂交育种鉴定上具有重要应用价值。利用其他引物对亲本及子代进行扩增均出现了不同类型条带(图2)，其中多数引物扩增出2个条带，其中1个为共有条带，引物的特异性不高。

注：M.分子标记；F.母本；Ma.父本；1-36.杂交子代。下同。

图2 部分引物对子代SSR扩增结果Fig.2 Molecular identification of hybrids (in part) using different SSR primers

2.2 杂交后代遗传多样性分析

利用21对引物对杂交后代及亲本进行扩增，共扩增出46个条带，其中多态性条带24个，多态性比率达52.17%。单个引物扩增出的带数为2～3，平均扩增等位基因位点2.14个，有效等位基因数(Ne)为1.37～2.68、平均值为1.79，其中JSSR311的有效等位基因数2.68最高。杂交后代群体间Shannon's信息指数(I)平均值为 0.64，期望杂合度(Hei)平均值为0.42，群体间平均遗传分化系数(Fst)为0.07，基因流(Nm)平均值为3.38，表明枣和酸枣杂交后代群体遗传多样性较高。分别以0、1标记等位基因的有无，将21对引物扩增出的条带进行统计分析，发现子代的21个等位基因位点符合1∶1分离，子代的3个等位基因符合3∶1分离规律，分别进行χ2适度性检测，其中3个等位基因位点出现了偏分离现象。

2.3 聚类分析

利用SSR扩增结果数据，对杂交亲本和179个杂交子代进行了UPGMA聚类分析(图3)。结果显示，杂交子代个体间相似系数介于0.64～0.97，在相似系数0.70附近可将群体分为3类。第1大类由172个子代与母本JMS2聚在一起、占子代总数的96%，第2大类由2个子代与父本单独聚为一类，第3大类由5个子代单独聚为一类。其中第1大类在0.72处可分为2个亚类，第1亚类62个子代与母本聚在一起，其中“17”和“92”2个子代与JMS2遗传距离最近，遗传相似系数达0.93；第2亚类包含110个子代处于母本和父本之间。母本JMS2与父本邢16被聚在首尾2处，96%的子代与母本JMS2聚为一类，表明杂交后代与母本的遗传相似度更高。此外，第3大类由5个子代单株在0.64处左右最先单独聚为一类，表明这5个子代与父母本遗传距离较远。

表2 杂交子代群体的遗传多样性Table 2 Genetic diversity of hybrid progeny

注：P<0.05，实际分离与理论分离有显著性差异。

3 结论与讨论

杂交育种可通过非同源染色体的自由组合和非姐妹染色单体片段的交换，使分散在不同染色体上的遗传物质重组，雌雄配子结合后会出现多种多样的变异个体，从而产生有利的遗传效应[24]。选配亲和力好且能产生非加性效应大的亲本组合，获得杂合程度高性状表现优异的F1的概率相对较大[25]。遗传多样性是物种遗传潜力和适应环境变化能力的重要指标[23]，它从基因水平上反映出群体的变异性，对亲本选配及优良子代初步筛选具有指导意义。冬枣×宁梨巨枣的子代经SRAP技术分析表明杂交后代具有丰富的遗传多样性[9]，冬枣×临猗梨枣的杂交后代出现了果实性状的广泛分离，并且选出4个综合性状优良的杂交后代株系[10]。本研究中枣和酸枣的杂交后代经21对SSR引物扩增，共发现24个多态性条带，多态性比例率达52.17%，Shannon's信息指数(I)平均值为0.64，期望杂合度(Hei)平均值为0.42，子代群体间平均遗传分化系数为0.07，表明杂交后代变异明显，具有丰富的遗传多样性，为杂交后代性状的遗传变异研究和优良株系的选择奠定了基础。

聚类分析图显示了杂交后代单株间的遗传相似度[26-27]。本研究聚类分析发现雄性不育‘JMS2’和酸枣‘邢16’的遗传相似系数位于0.71左右，且母本与父本明显被聚在首位2处。枣是由酸枣进化而来，二者在形态特征和生物学特性方面颇为相似[28]，经SSR分析发现枣和酸枣的遗传相似系数为0.79，并且将枣和酸枣材料划分为枣类、酸枣类和过渡类3个群体[29]，这与本研究结果是一致的，预计杂交后代根据遗传相似系数和性状表现可分为3个过渡群体，也反映了2个亲本的亲缘关系较远，杂交后代出现了丰富的遗传变异。枣品种间开展杂交，经聚类分析发现冬枣和宁梨巨枣杂交后代在相似系数0.594处聚为2类[9]，超过半数的杂交子代与父本亲缘关系较近。白杨的4个杂交新品种与父本毛白杨之间具有较高的遗传相似性，同时这4个新品种在叶、芽、物候等多个性状上与父本性状也非常接近[30]。指纹图谱分析发现枣品种之间平均相似系数为0.82[31]，优良单株群体内各样品间的遗传相似系数达0.979 2[32],本研究所得枣和酸枣杂交后代群体遗传相似系数0.64～0.97，96%的子代与母本的遗传相似系数较高，杂交后代与母本遗传关系较近。这可能与亲本遗传物质的传递直接相关，也与选择的引物数量及引物特征间接相关，但一般多以形态学上相似度判断亲缘关系的远近。

图3 179个杂交子代及亲本的SSR聚类分析图Fig.3 Dendrogram of 179 hybrids and their parents based on SSR markers

对杂交后代实生苗的叶片形状初步观察，有75%以上的单株叶片纵径变短，横径变宽，叶形指数变小，表现出偏母遗传的倾向。其中聚类分析显示与母本遗传距离最近的“17”号单株的叶形指数明显变小，与母本叶片相似度高，而与父本遗传距离最近的“42”号单株的叶片与父本相似，遗传距离与叶形指数表现一致。杂交子代结果单株中有9株果实呈长圆柱形，果实形状偏母本性状，3株呈圆形偏父本性状，由于结果单株少，果实性状分离规律和QTL性状定位还需后续详细研究。此外，有5个子代单独聚类于父、母本之外，占所有子代的3%，这种情况在茶树自然杂交后代群体的聚类分析中也有出现[33]。这些子代材料与父母本遗传距离较远，可能出现较大程度的性状变异，后续性状调查时对这些后代材料应该特别关注。

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