妊娠期糖尿病SD大鼠对子代糖脂代谢的影响

王辽菊，朱丽红，邰迎春

妊娠期糖尿病(GDM)是指妊娠期首次出现糖耐量受损或糖尿病的疾病，是产科的常见病[1]。家族中母亲患有糖尿病，子代糖尿病的发病率较高。女性在妊娠期或哺乳期出现高血糖，且血糖得不到有效控制时，其后代成年后代谢疾病的发病率明显增加[2]。GDM会使得子宫呈现高糖环境，其可能是子代成年后糖脂代谢紊乱的高危险因素。以往多是对妊娠期中后期轻度糖尿病对子代影响的研究，本研究通过建立妊娠期重度高血糖（即血糖＞15 mmol/L）大鼠GDM模型，探讨对子代糖脂代谢的影响，并探讨其发生机制，以为GDM的防治措施研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要仪器及试剂 链脲佐菌素（美国Sigma公司），人胰岛素注射液（诺和诺德制药有限公司），血糖仪（强生医疗器械有限公司），酶联免疫吸附测定试剂盒（美国R&D公司），miRNA RT-PCR试剂盒（上海生工生物）。

1.2 构建妊娠期高血糖动物模型 选择30只8周龄SPF级SD雌性大鼠，购自陕西中医药大学动物实验中心（SCXK 2017-007），体重 200～250 g。 饲养环境：普通饲料喂养，温度（22±1）℃，湿度 60%±5%，照明12 h。随机平均分为观察组与对照组。均与健康雄性SD大鼠交配，次日清晨观察雌鼠阴道，若能观察到阴栓，则为妊娠第0 d。在妊娠第1 d：观察组单次腹腔注射40 mg/kg链脲佐菌素，构建妊娠期高血糖动物模型；对照组则腹腔注射同体积柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（pH4.5）。观察组分别于妊娠期第5、12、19 d及分娩后第7 d，4次空腹采尾尖静脉血，血糖仪检测血糖值，如均＞15 mmol/L，则为妊娠期高血糖造模成功。

1.3 观察指标

1.3.1 两组子代血糖值比较 两组分娩后，幼鼠正常喂养，分别记为子代观察组（21只）及子代对照组（25只）。分别在分娩后7 d和喂养20 w时，进行葡萄糖耐量实验（GTT）：子代大鼠禁食16 h，并保持饮水充足，环境干燥、清洁，给予每只大鼠腹腔注射2 g/kg 的葡萄糖溶液，在注射后的第 0、30、60、90 及120 min，通过尾尖取血测量血糖值。

1.3.2 两组子代血脂水平比较 两组喂养至子代21 w时处死，收集血液样本，4℃、3000 r/min离心15 min，检测血清血脂水平，包括总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）与低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）。依据《血脂异常防治建议》的判定标准确定异常临界值[3]：即 TC＞5.57 mmol/L，T≥1.7 mmol/L，HDL-C＜0.91 mmol/L，LDL-C＞3.64 mmol/L。

1.3.3 两组子代肝脏相关基因相对表达量比较子代大鼠处死后，迅速取出肝脏，提取RNA，采用实时荧光定量PCR法检测过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARα）、肉毒碱棕榈酰基转移酶 1α（CPT-1α）、3-羟基酰基辅酶 A 脱氢酶（Ehhadh）、长链酯酰辅酶 A 合成酶 3（ASL3）、miRNA-214、miRNA-130a、miRNA-181a、miRNA-34a等基因相对表达量。

1.4 统计学方法 应用SPSS22.0统计软件分析，计量资料以±s表示，组间比较行t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组子代GTT血糖值比较 GTT结果显示，分娩后7 d，两组子代血糖比较无显著差异（P＞0.05）；但喂养20 w时，子代观察组的血糖水平显著高于子代对照组（P＜0.05，表 1）。

表1 两组子代GTT全血血糖值比较

表2 两组子代血脂水平比较(mmoI/L)

表3 两组子代肝脏相关基因相对表达量比较

2.2 两组子代血清血脂水平比较 喂养21 w时，子代观察组的TC、TG和LDL-C水平显著高于子代对照组（P＜0.05），而HDL-C明显低于子代对照组（P＜0.05，表 2）。

2.3 两组子代肝脏相关基因相对表达量比较 喂养21 w时，子代观察组肝脏PPARα和Ehhadh相对表达量显著高于子代对照组 （P＜0.05），miRNA-130 a和ASL3明显低于子代对照组（P＜0.05），而两组肝脏 CPT-1α、miRNA-214、miRNA-181a 及 miRNA-34a则无显著差异（P＞ 0.05，表 3）。

3 讨论

以往文献多偏重于妊娠中后期轻微妊娠期糖尿病大鼠对子代的影响研究，本研究选择妊娠期血糖＞15 mmol/L的严重妊娠期糖尿病大鼠，探讨其对子代成年大鼠糖脂代谢的影响，并从miRNA层面探讨其发生机制。结果发现，两组子代大鼠GTT血糖值在分娩后7 d无显著差异，而在喂养20 w时，子代观察组明显高于子代对照组，表明妊娠期重度糖尿病可引起子代成年后血糖紊乱。而在21 w时的血清血脂水平比较，子代观察组的TC、TG、HDL-C与LDL-C与子代对照组对比均有差异，说明妊娠期重度糖尿病引起子代成年后血脂水平异常的风险增大。

妊娠期高血糖大鼠是如何对子鼠出生及成年以后的糖脂代谢产生影响的，目前尚不清楚，本研究从肝脏相关基因表达差异上进行了探讨。miRNA是单链非编码小RNA，调节mRNA翻译，抑制靶mRNA剪接或翻译来调节靶基因的表达，对基因转录后调节有重要作用[4]。研究发现，miRNA-214、miRNA-130a、miRNA-181a、miRNA-34a 对 糖 代 谢 调控有重要作用，其中miRNA-130a在大鼠高糖时，其表达水平会下降。在胰岛细胞中敲除miRNA-130a基因后，可对葡萄糖刺激的胰岛素释放产生抑制作用[5]。本研究结果表明，子代观察组的miRNA-130a表达量明显低于子代对照组，表明妊娠期糖尿病母鼠会对子代的miRNA-130a基因产生明显影响，从而影响子代的糖代谢。

肝脏作为机体脂代谢的核心器官，对脂质的摄取、合成、分解及输出有调控作用，其中PPARα、CPT-1α、Ehhadh、ASL3 对脂代谢调控有重要作用[6]。PPARα基因表达下调时，会降低线粒体β的氧化能力，增加脂代谢疾病的易感性[7]；ASL3过表达会促进细胞摄取脂肪酸，是调控脂质合成的一个重要信号分子[8]；胚胎发育早期恶劣的母体环境，子代肝脏内的Ehhadh基因出现代偿性表达增加，脂肪酸β的氧化增加，降低肝内脂肪酸含量[9]。本研究发现，子代观察组的PPARα、Ehhadh明显高于子代对照组，ASL3明显低于子代对照组，表明妊娠期糖尿病会影响子代的 PPARα、Ehhadh、ASL3基因水平，从而影响子代脂代谢。

综上所述，妊娠期重度糖尿病可引起子代成年后糖脂代谢紊乱，而肝脏相关基因表达异常可能是糖脂代谢紊乱的原因，应进一步研究证实。