3-香豆素甲酸乙酯类化合物的制备与抗真菌活性

史晨燕，李浩鹏，刘睿媛，耿会玲

(西北农林科技大学 化学与药学院，陕西 杨陵 712100)

香豆素是一类具有α-苯并吡喃酮结构的天然产物，其广泛分布于伞形科、芸香科、桑科等高等植物及微生物代谢产物中[1]，不仅是药用植物的主要活性成分之一，而且具有丰富多样的生理活性，如抗肿瘤、抗氧化、抗菌、抗HIV、抗炎、抗癌、抗凝血等[2-5]。此外，该类化合物也被广泛应用于荧光染料、激光染料、荧光增白剂、发光材料、荧光探针及非线性光学材料等[6-7]领域。1978年，M.Berenbaum[8]首次报道了花椒毒素这一典型香豆素对植食性昆虫的光活化毒性，引起了人们对天然香豆素在农作物病菌和害虫防治方面研究的关注。蛇床子素不仅对常见农作物的植物病原真菌具有广谱抑制活性[9-12]，还对菜青虫、小菜蛾幼虫等害虫具有触杀作用[13]，是香豆素类化合物在农业上成功应用的典范。此后，掀起了从香豆素类化合物中筛选“低毒、高效、低残留”生物农药的热潮。但天然香豆素在植物中含量较低，无法满足市场需求，限制了它们的广泛应用，因此，借助化学合成实现其规模化生产。该类化合物的经典合成方法有Perkin反应、Wittig反应、Pechmann反应等[14-16]，近年来又发展了Mukaiyama酯化反应、多米诺反应、微波辅助法等简洁、高效、绿色的新合成方法[17-19]。

本研究以取代水杨醛即邻羟基苯甲醛为原料，在有机碱催化下[20]，采用改进的Knoevenagel缩合法合成了15种3-香豆素甲酸乙酯类化合物，并测定其对12种常见植物病原真菌的抑制活性，为香豆素类抗菌素的研发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 供试的马铃薯干腐(Fusariumsolani,缩写为FS)、苹果轮纹(Botryosphaeriadothidea,缩写为BD)、玉米弯孢(Curvularialunata,缩写为CL)、棉花枯萎(Fusariumoxysporumf.sp.Vasinfectum,缩写为FOV)、苹果炭疽(Colletotrichumgloeosporioides,缩写为CG)、苹果腐烂(Valsamali,缩写为VM)、西瓜枯萎(Fusariumoxysporumsp.niveum,缩写为FON)、小麦赤霉(Fusariumgraminearum,缩写为FG)、白菜黑斑(Alternariabrassicae,缩写为AB)、烟草赤星(Alternariaalternate,缩写为AA)、南瓜枯萎(Fusariumbulbigenum,缩写为FB)和水稻稻瘟菌(Pyriculariaoryza,缩写为PO)等12种植物病原真菌均由西北农林科技大学无公害农药研究中心提供。

1.1.2 仪器与试剂 XT-4显微熔点仪(温度计未校正，北京泰克仪器有限公司)，Bruker AVANCE III 500 MHz核磁共振仪(德国Bruker公司)，Finnigan Trace质谱仪(美国Themo Finnigan公司)。

醚菌酯(Kresoxim-methyl，缩写为KM，≥99%)，阿拉丁试剂股份有限公司；DMSO，成都市科龙化工试剂厂；琼脂粉，北京索莱宝科技有限公司；葡萄糖，广东光华科技股份有限公司；取代水杨醛，北京伊诺凯试剂公司；医用酒精、丙二酸二乙酯、哌啶、无水乙醇等均为市售分析纯试剂。

1.2 目标化合物的合成

以哌啶为催化剂，使取代邻羟基苯甲醛(取代水杨醛)与含有活泼亚甲基的丙二酸二乙酯在无水乙醇中发生缩合反应，得到取代3-香豆素甲酸乙酯A1～A15，合成路线见图1。

图1 目标化合物的合成路线Fig.1 Synthetic route for the target compounds

以化合物A1即3-香豆素甲酸乙酯的合成为例[21]：向干燥的圆底烧瓶中依次加入水杨醛(4.9 g,4.3 mL,40 mmol)、丙二酸二乙酯(7.25 g,6.8 mL,45 mmol)、25 mL无水乙醇、0.5 mL哌啶和1～2滴冰醋酸，装上冷凝管和干燥管后加热至回流；TLC跟踪检测，2 h后反应完全。待反应液冷却至室温后转入锥形瓶内，向其中加入3～5 mL水，冰水浴冷却使产物完全析出；减压抽滤，产物用冷却的50%乙醇洗涤2次(每次3～5 mL)，抽干，得白色晶体。用乙醇∶水=1∶3(v∶v)重结晶，称重，得7.3 g产物，产率为83.4%。以相应的取代水杨醛为原料，采用相同的方法合成A2～A15。

1.3 结构表征

用显微熔点仪测定了化合物A1～A15的熔点，采用质谱(ESI-MS)和核磁共振谱(1H NMR、13C NMR)对其结构进行了表征。

1.4 体外抗菌活性测定

采用菌丝线性生长速率法测定了所有化合物对马铃薯干腐、苹果轮纹、玉米弯孢等12种植物病原真菌的抑制活性[22-25]。以50 μg·mL-1的醚菌酯溶液为阳性对照，以5%的DMSO水溶液作为空白对照，将已准确称量的待测化合物完全溶于5%(v/v)的DMSO水溶液中，将10 mL待测液或对照液与90 mL无菌PDA培养基在50℃快速混匀，得到浓度为50 μg·mL-1的含药液；将其趁热倒入已灭菌的培养皿内，每皿10 mL，冷却备用。把供试病原菌(菌饼直径5 mm)接种到上述培养皿中，每个测试组设3个平行；将其置于湿度为60%、28℃的恒温培养箱中培养72 h后，采用十字交叉法测量菌落直径(mm)，按式(1)计算菌丝生长抑制率(inhibition rate,IR)：

IR(%)=[(dc-d0)-(ds-d0)]/(dc-d0)×100

(1)

式中：d0为菌饼直径(5 mm)，dc为空白对照组菌落平均直径，ds为样品组菌落平均直径(mm)。

设7个浓度，采用相同方法测定A6及阳性对照的EC50值。

2 结果与分析

2.1 3-香豆素甲酸乙酯类化合物的结构表征

采用上述方法合成了15种3-香豆素甲酸乙酯类化合物(A1～A15)，其物理性质和质谱(ESI-MS)数据见表1，核磁共振氢谱和碳谱(1H NMR和13C NMR)数据见表2。

由表2可知：在1H NMR谱中，所有化合物在δH8.49～8.96范围内都出现单峰，这是4号碳上氢原子的信号峰。此外，A系列化合物在δH4.45～4.36范围内均出现4重峰，这是乙基中亚甲基上的氢信号；在δH1.43～1.39范围内出现3重峰，这是乙基中甲基上的氢信号；它们的耦合常数均为7.1 Hz。在13C NMR谱中，所有化合物在δC162.1～165.1和δC154.6～161.9范围内出现2个酯羰基信号峰。

表1目标化合物的物理性质及质谱数据
Table 1 Physical properties and ESI-MS data of the target compounds

化合物取代基R熔点/℃物态(室温)CAS号收率质谱ESI-MS m/z预测值测量值A1H89.0～92.7白色晶体1846-76-083218.21219.02 [M+H]+A28-CH342.3～43.6黄色固体17349-63-285232.24255.09 [M+Na]+A37-CH375.1～76.5黄色固体327613-94-588232.24255.17 [M+Na]+A46-CH3102.0～104.3淡黄色固体54396-24-688232.24255.13 [M+Na]+A58-OCH387.1～89.3白色固体1729-02-892248.23271.87 [M+Na]A67-OCH3133.6～134.8白色固体6093-72-789248.23271.90 [M+Na]+A76-OCH3139.8～141.0黄色固体41459-71-688248.23271.13 [M+Na]+A88-OH173.3～174.6白色固体108170-58-789234.21490.73 [2M+Na]+A97-OH166.3～167.2淡黄色固体6093-71-687234.21490.77 [2M+Na]+A106-OH184.0～185.8棕色固体70160-51-986234.21490.75 [2M+Na]+A118-F92.5～93.7黄色固体1821196-31-986236.20259.14 [M+Na]+A126-F87.5～88.4淡黄色固体70384-81-590236.20259.20 [M+Na]+A136-Cl159.2～160.5黄色固体70384-80-488252.65274.84 [M+Na]+A146-Br170.2～171.3淡黄色固体2199-90-893297.10616.57 [2M+Na]+A156-NO2198.5～199.3黄色固体13373-28-992263.21550.68 [2M+Na]+

2.2 目标化合物抗菌活性初筛结果

测定了15种目标化合物在50 μg·mL-1时对12种供试菌的体外抑制活性，结果见表3。由表3可知：大多数目标化合物在50 μg·mL-1对供试菌具有不同程度的抑制活性。相比较而言，供试化合物对苹果腐烂、苹果炭疽、苹果轮纹病原菌的抑制活性较高，说明这3种菌为其敏感菌株。苯环上引入取代基有助于提高活性，但给电子取代基的化合物的抑菌活性大都高于吸电子取代基者，如7-甲氧基取代的A6对苹果腐烂病原菌的抑制活性最高，我们采用相同方法测定了其对2种敏感菌的毒力方程和EC50值。

由表4可知：A6对苹果腐烂病原菌的EC50值(65.4 μg·mL-1)高于阳性对照醚菌酯(84.7 μg·mL-1)，但对苹果轮纹病原菌的活性远低于醚菌酯。

3 结论与讨论

采用Knoevenagel缩合法实现了目标化合物的合成，通过ES-IMS和NMR谱确认了它们的结构。在母核6/7/8位即苯环不同位置引入给电子取代基甲基、甲氧基、羟基或吸电子取代基氟、氯、溴和硝基，以丰富3-香豆素甲酸乙酯类化合物并考察不同类型取代基对其抗真菌活性的影响。其初步构效关系为：1)对绝大多数供试菌而言，无论向苯环引入吸电子取代基还是给电子取代基，对该类化合物的抗菌活性均有不同程度的提高；2)相比较而言，带有给电子取代基化合物的抗菌活性基本高于吸电子取代基者，如7-OCH3取代产物A6的活性总体较高，而6-NO2取代产物A15的活性普遍较低；3)对于带给电子取代基的产物而言，不同取代基对活性的影响顺序大致为甲氧基>甲基>羟基；对于同一取代基而言，其活性顺序为7位>6位>8位；4)对于吸电子取代基而言，6-NO2取代产物A15的活性大都<卤素取代产物的活性；5)A6对苹果腐烂病原菌的活性最高，其EC50值(65.4 μg·mL-1)>阳性对照醚菌酯(84.7 μg·mL-1)。

表2 目标化合物的1H NMR和13C NMR数据Table 2 The 1H NMR and 13C NMR data of the target compounds

3-香豆素甲酸乙酯类化合物是农用抗菌剂家族中的新成员，虽然关于香豆素类化合物的合成及其生物活性的研究已有报道[26-27]，但目前尚没有对该类化合物抗菌活性的系统研究，母核同一位置的不同取代基对其活性的影响、同一取代基在不同位置对其活性的影响、大位阻取代基对其活性的影响规律并不清楚，不同类型香豆素的抗菌谱及其作用机制也尚不明确，这有待于我们进一步深入研究。

表3 目标化合物抗真菌活性初测结果(50 μg·mL-1,72 h)Table 3 Results of preliminary antifungal activities of title compounds (50 μg·mL-1,72 h)

表4 化合物A6对部分供试病菌的毒力方程及EC50值Table 4 Toxicity regression equations and EC50 values of A6 against tested fungi μg·mL-1

注：*公式中y:抑制率的几率值；x:lgC(pg·mL-1)。

参考文献:

[1] 徐任生.天然产物化学[M].北京:科学出版社,1993:608-609.

[2] KEMPEN I,PAPAPOSTOLOU D,THIERRY N,etal.3-Bromophenyl 6-acetoxymethyl-2-oxo-2H-1-benzopyran-3-carboxylate inhibits cancer cell invasion in vitro and tumor growth in vivo [J].British Journal of Cancer,2003,88(7):1111-1118.

[3] SPINO C,DODIER M,SOTHEESWARAN S.Anti-HIV coumarins from calophyllum seed oil [J].Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters,1998,8(24):3475-3478.

[4] NASR T,BONDOCK S,YOUNS M.Anticancer activity of new coumarin substituted hydrazide-hydrazone derivatives [J].European Journal of Medicinal Chemistry,2014,76(7):539-548.

[6] DANKO M,SZABO E,HRDLOVIC P.Synthesis and spectral characteristics of fluorescent dyes based on coumarin fluorophore and hindered amine stabilizer in solution and polymer matrices [J].Dyes & Pigments,2011,90(2):129-138.

[7] HELAL A,RASHID MHO,CHOI C,etal.Chromogenic and fluorogenic sensing of Cu2+based on coumarin [J].Tetrahedron,2011,67(15):2794-2802.

[8] BERENBAUM M.Toxicity of a furanocoumarin to armyworms:a case of biosynthetic escape from insect herbivores[J].Science,1978,201(4355):532-534.

[9] 朱述钧,王春梅,沈寿国,等.香豆素类化合物在农业上的应用[J].江西农业学报,2006,18(2):97-100.

ZHU S J,WANG C M,SHEN S G,etal.Application of coumarin in agriculture [J].Acta Agriculturae Jiangxi,2006,18(2):97-100.(in Chinese)

[10] 王超,严清平.蛇床子素防治板蓝根霜霉病、黄瓜瓜绢螟的应用效果[J].江苏农业科学,2003(Supp.1):144-146.

[11] 石志琦,沈寿国,徐朗莱,等.蛇床子素对植物病原真菌抑制机制的初步研究[J].农药学学报,2004,6(4):28-32.

SHI Z Q,SHEN S G,XU L L,etal.Inhibition mechanism of osthol to plant fungus pathogens [J].Chinese Journal of Pesticide Science,2004,6(4):28-32.(in Chinese)

[12] WARWAR V,DICKMAN M B.Effects of calcium and calmodulin on spore germination and appressorium development in colletotrichum trifolii [J].Applied & Environmental Microbiology,1996,62(1):74-79.

[13] 王华,鲁小梅,姚虎,等.香豆素及其衍生物的应用研究进展[J].化工时刊,2009,23(8):40-43.

WANG H,LU X M,YAO H,etal.Research progress on application of coumarin and its derivatives [J].Chemical Industry Times,2009,23(8):40-43.(in Chinese)

[15] LIU G L,HAO B,LIU S P,etal.Synthesis and anthelmintic activity of osthol analogs againstDactylogyrusintermedius in goldfish [J].European Journal of Medicinal Chemistry,2012,54(11):582-590.

[16] GU Y L,ZHANG J,DUAN Z Y,etal.Pechmann reaction in non-chloroaluminate acidic ionic liquids under solvent-free conditions [J].Advanced Synthesis & Catalysis,2010,347(4):512-516.

[17] BISHT S,PEDDINTI R K.Domino reactions of alkenyl p-benzoquinones:access to aryl sulfide derivatives of coumarins [J].Tetrahedron,2017,73(18):2591-2601.

[18] LI G T,LI Z K,GU Q,etal.Asymmetric synthesis of 4aryl-3,4-dihydrocoumarins by Nheterocyclic carbene catalyzed annulation of phenols with enals [J].Organic Letters,2017,19(6):1318-1321.

[19] YAO P E,KUMAR S,LIU Y L,etal.Diversity-oriented synthesis of coumarin-linked benzimidazoles via a one-pot,three-step,intramolecular Knoevenagel cyclization [J].Acs Combinatorial Science,2017,19(4):271-275.

[20] KOEPP E,VOGTLE F.Synthesis of coumarins [J].Synthesis,1997(2):175-180.

[21] 丁旭东.香豆素的合成及生物活性研究[D].陕西杨陵:西北农林科技大学,2010.

[22] LI M H,PETERSEN J L,HOOVER J N,etal.Silver-mediated oxidative decarboxylative trifluoromethylthiolation of coumarin-3-carboxylic acids [J].Organic Letters,2017,19:638-641.

[23] 吴文君.植物化学保护实验技术导论[M].西安:陕西科学技术出版社,1988:123-127.

[24] 王芳,梁倩,杨建珍,等.倒提壶(紫草科Boraginaceae)提取物抗菌活性的初步研究[J].西北林学院学报,2014,29(5):125-128.

WANG F,LIANG Q,YANG J Z,etal.Anti-microbial activity of the extracts fromCynoglossumamabile[J].Journal of Northwest Forestry University,2014,29(5):125-128.(in Chinese)

[25] 田小曼,陈阿敏.火棘抑菌内生真菌的筛选与拮抗植物病原菌作用研究[J].西北林学院学报,2012,27(5):117-120.

TIAN X M,CHEN A M.Screening of pyracantha fortuneana endophytic fungus and function examination of antagonism to plant pathogenic fungi [J].Journal of Northwest Forestry University,2012,27(5):117-120.(in Chinese)

[26] 刘斌,谢龙观,徐效华,等.3-苯甲酰基-4-羟基香豆素衍生物的合成、晶体结构及其除草活性研究[J].有机化学,2011,31(12):2067-2073.

LIU B,XIE L G,XU X H,etal.Synthesis,crystal structure and herbicidal activity of 3-benzoyl-4-hydroxycoumarin derivatives [J].Chinese Journal of Organic Chemistry,2011,31(12):2067-2073.(in Chinese)

[27] 李淼,刘长令,张明星,等.丁香菌酯(SYP-3375)的设计、合成及杀菌活性[J].农药学学报,2010,12(4):90-94.

LI M,LIU C L,ZHANG M X,etal.Design,synthesis and fungicidal activity of coumoxystrobin (SYP-3375) [J].Chinese Journal of Pesticide Science,2010,12(4):90-94.(in Chinese)