他莫昔芬对荷瘤裸鼠乳腺癌血管生成和增殖的作用

熊倩 刘秋虹 吴清萍 石玉梅

乳腺癌已成为女性恶性肿瘤发病率的第一位，恶性程度高，侵袭性明显，复发﹑转移几率大。他莫昔芬（TAM）是目前雌激素受体（ER）表达阳性的乳腺癌的一线药物，其在乳腺组织中能竞争性与雌激素受体结合，从而阻碍ER表达阳性的乳腺肿瘤的生长和繁殖。肿瘤的增殖及新生血管能力在肿瘤的生长﹑转移﹑过程中发挥着重大的作用，目前用阻断肿瘤血管来治疗肿瘤的方法正逐步探讨及应用。本实验通过乳腺癌MCF-7细胞裸鼠成瘤，TAM治疗后肿瘤检测直径大小及增殖标记（CyclinD1﹑Ki67）﹑血管标记（VEGF﹑CD34）的变化，探讨TAM对乳腺癌的抗细胞增殖及血管形成的作用，期望为实验室及临床提供实验数据。

1 材料与方法

1.1 建立MCF-7乳腺癌细胞荷瘤裸鼠模型。乳腺癌MCF-7细胞由苏州大学第一附属医院核医学实验室留存；雌性BALB/c裸鼠，4～5周龄，20只，上海斯莱克实验动物有限公司。人乳腺癌MCF-7细胞株培养至对数生长期，无菌条件下接种于裸鼠右侧腋窝偏前脂肪垫下，继续饲养于无菌层流罩中。种瘤6～9d后裸鼠右侧胸壁皮下可触及瘤结节，20只均建模成功。自裸鼠接种MCF-7细胞次日起，于右侧胸壁瘤旁皮下注0.15mg/ml雌激素0.2ml/（只·d），直至取瘤。

1.2 实验分组及干预 将建模成功荷瘤裸鼠（细胞接种后第10天）随机分为观察组及对照组，每组各10只。观察组给予 TAM 5mg/（kg·d） 灌胃 1 次，对照组给药蒸馏水2ml灌胃。

1.3 肿瘤病理学检测 用药21d后脱颈处死裸鼠取瘤，记录肿瘤大小﹑质地情况，肿瘤平均直径=（最大直径+最小直径）/2。肿瘤10%福尔马林固定24h，常规脱水包埋HE染色。

1.4 免疫组化SP法检测 结果由三位高年资病理科医师阅片，并对免疫结果做定量分析。CyclinD1﹑Ki67阳性表达在细胞核，随机选取 10个高倍视野，每个视野计数 100个肿瘤细胞，计数阳性细胞百分比例。VEGF阳性表达在胞浆/胞膜，采用半定量分析法0%～5%为0分，6%～25%记1分，26%～50%记2分，51%～75%记3分，＞75%记4分；染色强度：无着色0分，淡黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分；两个值相乘为最终判读结果。CD34标记微血管密度（MVD）先在低倍镜下找血管丰富区域，然后在高倍镜下计数5个不同区域的血管数，然后求其平均值作为MVD值。以镜下胞质内有棕黄色颗粒标记为血管内皮细胞阳性。肿瘤内坏死区及与肿瘤交界处软组织内的微血管不计数，有厚平滑肌壁的血管也排除在外。

1.5 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。计量资料以（）表示，组间比较采用t检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肿瘤大体检测及直径测量 肿瘤多为椭圆，巨检与周围组织分界尚清，切面灰白，质地稍硬，测量直径=（最大直径+最小直径）/2。观察组肿瘤平均直径（0.9600±0.12649）cm，对照组肿瘤平均直径（1.0800±0.15492）cm，两组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。肿瘤直径曲线图见图1。

图1 肿瘤直径（cm）曲线图

2.2 免疫组化结果 见表1和图2～13。

图2 ：乳腺癌MCF细胞种植裸鼠成瘤HE染色，细胞弥漫生长，部分区域可见坏死灶。图3：高倍镜下肿瘤细胞密集，核仁明显，偶见核分裂象。图4：免疫组化CKpan标记，肿瘤细胞强阳性，周边脂肪细胞阴性，印证肿瘤细胞上皮来源。图5-6：对照组及观察组肿瘤免疫组化Ki67标记。图7-8：对照组及观察组肿瘤免疫组化CyclinD1标记。图9-10：对照组及观察组肿瘤免疫组化VEGF染色，肿瘤胞浆深浅不等褐染。图11-13：肿瘤血管内皮CD34标记，其中11为对照组肿瘤内血管以小血管为主，管腔不规则，内皮细胞部分核较大；图12为观察组CD34染色；图13为肿瘤周边与脂肪组织交界处，可见脂肪中形态温和血管

表1 观察组和对照组免疫指标评分比较（）

表1 观察组和对照组免疫指标评分比较（）

组别 观察组（n=10） 对照组（n=10） t值 P值CyclinD1（%） 19.8000±3.76534 15.6000±1.77639 2.957 0.016 Ki67（%） 35.6000±5.6112 29.9000±4.30633 2.703 0.024 VEGF 8.7000±01.63639 7.4000±1.26491 2.899 0.018 CD34 87.0000±10.42433 79.4000±6.44981 2.403 0.040

3 讨论

本研究MCF-7乳腺癌荷瘤裸鼠经TAM灌胃治疗21d后，观察组和对照组直径大小变化差异无统计学意义（P＞0.05）。但细胞增殖指标及血管计数有变化，可能有以下原因：（1）每只小白鼠对肿瘤细胞的耐受程度不完全相同，处死前期大部分老鼠已经出现极度消瘦﹑恶病质现象，但有2只荷瘤裸鼠状态基本正常。（2）每只荷瘤裸鼠对他莫昔芬的敏感性有轻微差异。（3）他莫昔芬临床应用长期效果较好，本实验可能时间较短。动物实验将用药外其它因素尽量保持一致，但实验分组对照试验与临床用药前后肿瘤大小的比较尚有一定的区别。

乳腺癌MCF-7裸鼠肿瘤组织常规病理HE染色显示，肿瘤细胞弥漫生长，间质较少，细胞多边形，部分区域可见坏死灶，高倍镜下可见肿瘤细胞核仁明显，偶见核分裂象。肿瘤巨检边界尚清，但镜下可明确肿瘤无包膜，免疫组化作CKpan标记显示：肿瘤浸润至周围脂肪组织中，交界处褐色为肿瘤细胞，白色为脂肪组织，同时显示了肿瘤细胞上皮来源特性。

细胞周期的启动G1期的是关键，而CyclinD1是调控G1期的细胞周期素依赖激酶的调节因子。卢梦玲等［1］陈述CyclinD1的主要功能是促进细胞增殖，其过度表达可致细胞失控而恶性变。也有学者［2］证明阿司匹林联合他莫昔芬可下调乳腺癌细胞周期蛋白D1并阻断G0 / G1期细胞周期。Ki-67最早在1983年由Gerdes等［3］在检测一种淋巴瘤细胞核抗原时发现的，其表达增强是细胞增生活跃的一个反映。余海等［4］报道乳腺癌新辅助化疗后Ki67可有明显降低。本资料研究荷瘤裸鼠乳腺癌经TAM灌胃治疗21d后与对照组比较增殖指标CyclinD1﹑Ki67的变化，二者的阳性表达均在细胞核，棕色至褐色不等，与对照组比较，TAM灌胃组增殖指标的表达评分均下降且差异有统计学意义（P＜0.05），证明他莫昔芬对乳腺癌肿瘤细胞有抑制增殖的作用。

血管不但可以为肿瘤细胞提供需要的营养物质，运走代谢产物，近年来对肿瘤血管的研究逐渐增多。VEGF 是乳腺癌血管新生过程中最重要的促血管生成因子之一，在多种肿瘤组织中均表达，而且VEGF表达的浓度可以作为肿瘤预后的先兆指标。有研究［5］表明他莫昔芬可抑制SK-BR-3 乳腺癌细胞株裸鼠血清中VEGF的分泌，降低肿瘤组织中VFGF的表达。还有研究［6］显示在肝细胞癌的诊治过程中，可以动态监测血VEGF水平及蛋白表达水平，动态评估肿瘤的疗效及进展。CD34分子是高度糖基化的跨膜糖蛋白，可以在血管内皮中表达。有学者［7］指出CD34被称为微血管密度研究的最佳标记物。本资料观察组VEGF阳性表达在胞浆/膜，免疫组化结果表现为深浅不等的弥漫或成片的棕褐色，CD34表达在血管内皮细胞呈阳性，结果显示，观察组与对照组比较表达水平均下调且差异有统计学意义（P＜0.05），表明他莫昔芬对肿瘤的血管生成有抑制作用。从血管指标CD34的免疫组化结果分析，肿瘤组织中的微血管密度大，尤其是肿块周边地区，中心部分可见小灶状缺血坏死。肿瘤血管形态极不规则，多为分支状，内皮细胞增生活跃，肿瘤表面的脂肪组织中血管密度明显降低，且多为薄壁略扩张的小血管，形态较温和。VEGF肿瘤细胞几乎全部为阳性表达，所以免疫组化评分主要依赖色差。由于免疫组化染色的深浅容易受多种因素的干扰，故采用免疫组化方法判定肿瘤血管的变化VEGF并非最理想指标。

综上所述，CyclinD1﹑Ki67通过促进肿瘤细胞的增殖而促进癌的生长发展，VEGF﹑CD34通过血管内皮细胞的增殖，提高内皮细胞通透性来促进“养料”的运输﹑肿瘤的转移。TAM作为乳腺癌内分泌药物，除了与肿瘤细胞竞争雌激素受体，使肿瘤细胞“养分”减少而直接抑制肿瘤细胞外，还可以抑制微血管的生成，减少肿瘤“养分”的运输，期望对未来肿瘤实验室及临床诊治提供新的诊疗途径。

［1］ 卢梦玲,闫超,赖多,等．Cyclin D1与细胞周期调控．生物技术通报,2011,11(10):55-59．

［2］ Cheng R,Liu YJ,Cui JW,et al．Aspirin regulation of c-myc and cyclinD1 proteins to overcome tamoxifen resistance in estrogen receptor-positive breast cancer cells．Oncotarget,2017,8(18):30252．

［3］ Gerdes J,Schwab U,Lemke H,et al．Production of a mouse monoclonal antibody reactive with a human nuclear antigen associated with cell proliferation．Int J Cancer,1983,31(1):1．

［4］ 余海云,李文萍,郜红艺,等．新辅助化疗疗效与乳腺癌Ki67、P53表达的关系．中华乳腺病杂志(电子版),2011,5(3):297-305．

［5］ 赵明智．他莫昔芬对SK-BR-3乳腺癌细胞株荷瘤裸鼠血管生成的作用及机制研究．河北大学,2015．

［6］ Liu K,Min XL,Peng J,et al．The Changes of HIF-1 and VEGF expression after tace in patients with hepatocellular carcinoma．Journal of Clinical Medicine Research, 2016, 8(4): 297-302．

［7］ Xiangyi Kong, Jian Guan, Wenbin Ma, et al． CD34 Over-Expression is Associated With Gliomas' Higher WHO Grade．Medicine, 2016,95(7):e2830．