外源硫化氢通过清除4-HNE抑制肝细胞死亡的分子机制研究

马旺 丁滨 丁秦超 王萃 任宣奇 窦晓兵★

酒精性肝病（ALD）是由于长期过度饮酒导致的肝脏疾病，近年来我国ALD的发病率及病死率也呈现逐年增长趋势，已成为仅次于病毒性肝炎的第二大肝病。4-羟基壬烯酸（4-HNE）是肝脏长期暴露于酒精后产生的一种肝细胞致敏因子，其对肝脏蛋白的修饰会促进ALD的形成，在ALD 的发生发展过程中起着至关重要的作用［1］。近年来研究证实，H2S以4-HNE为靶点具有治疗多种疾病的潜质［2-3］。但是H2S和4-HNE 的相关研究在肝病中未见报道。本研究旨在证明是否可以通过补充外源H2S，进而通过清除4-HNE，从而抑制肝细胞死亡。在本研究中以人的肝癌细胞系HepG2为细胞模型，进行细胞培养及药物干预，通过MTT法﹑LDH活性检测﹑ELISA以及Western Blot技术探究H2S对4-HNE诱导肝细胞死亡的抑制作用及分子机制，为在体内动物实验水平阐明ALD的发生发展过程提供新的思路，为ALD的临床治疗提供新的策略，也为以4-HNE为靶点的新型药物的研发提供重要的理论指导和依据。

1 材料和方法

1.1 主要实验材料与试剂 细胞：人肝癌细胞HepG2购自中科院上海细胞库。试剂：4-HNE购自Cayman Chemical公司；β-Actin 抗体购自武汉博士德公司；4-HNE抗体购自R&D公司；H2S检测试剂盒购自上海桥杜生物有限公司；LDH细胞毒性检测试剂盒购自Thermo scientific；其他实验试剂均购自Sigma Aldrich公司。

1.2 方法 （1）细胞培养及分组：人肝细胞HepG2用含10%胎牛血清﹑青霉素100 U/ml﹑链霉素100 mg/L的DMEM培养液于37℃，5% CO2条件下培养。取对数生长期的细胞制备人肝癌细胞HepG2单细胞悬液，细胞按2×105个/ml密度接种于24孔培养板内，每孔1ml，分成4组：①空白对照组（UT）：不作任何药物处理；②4-HNE组：单加20μmol/L 4-HNE处理；③NaHS组：单加0.4mmol/L的NaHS处理；④4-HNE+NaHS组：NaHS预处理2h后再加入4-HNE处理。以上四组每组设3个重复孔，均处理18h。（2）细胞增殖测定（MTT法）：将上述细胞按2×105个/ml密度制备单细胞悬液，每孔200μl接种于96孔培养板内，每组重复6孔，置培养箱中培养24h后进行药物孵育。再加入20μl MTT溶液在培养箱内继续培养4h后，弃去孔中所有培养液，各孔加入150μl DMSO，于摇床上振荡10min待紫色结晶充分溶解后在酶标仪490nm波长处测定并记录吸光度值A490。（3）乳酸脱氢酶（LDH）活性检测：根据LDH检测试剂盒说明测定各组细胞培养上清液中LDH水平，分析各组间的药物对细胞的毒性作用。（4）酶联免疫吸附实验（ELISA）检测细胞内H2S水平：细胞经药物干预后用液氮反复冻融及RIPA裂解液裂解从而使得细胞内H2S释放出来，根据ELISA试剂盒（上海桥杜生物公司）说明书操作，经包被，样本孵育，封闭，一抗孵育，二抗孵育，显色，终止等步骤检测细胞内H2S水平。（5）蛋白质免疫印迹法（WB）检测蛋白表达：细胞培养及药物孵育后，PBS洗涤细胞两次，加入含有PMSF﹑Na3VO4﹑NaF﹑蛋白酶抑制剂的RIPA蛋白裂解液，置冰上裂解≥30min，4℃下以12000r/min离心10 min后取上清液，用BCA试剂盒测定提取液中的蛋白质浓度。将各组调整至同一水平后，以20μg上样量备样，经SDSPAGE电泳﹑转移电泳﹑封闭﹑抗体免疫﹑显影﹑曝光等步骤检测蛋白表达情况（以β-actin做内参对照）。

1.3 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件。计量资料以（）表示，组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 外源NaHS（H2S前体）能升高肝细胞内H2S水平 利用H2S ELISA试剂盒检测HepG2细胞内H2S水平，实验结果显示，4-HNE单独作用HepG2肝细胞时，细胞内H2S水平与对照组比较明显降低（P＜0.05），若先用0.4mmol/L的NaHS预处理HepG2肝细胞后，发现细胞内H2S水平显著升高（P＜0.05），见图1。

图1 外源NaHS（H2S前体）能升高肝细胞内H2S水平

2.2 外源NaHS（H2S前体）显著抑制4-HNE诱导的肝细胞死亡 通过MTT法检测的结果显示，随着4-HNE浓度升高，其对细胞杀伤作用显著增强（P＜0.05），见图2A。用不同浓度NaHS预处理HepG2细胞后结果显示，随着NaHS浓度升高，其细胞活性比单独4-HNE处理组明显增强（P＜0.05），见图2B。LDH活性检测结果表明，用4-HNE单独作用HepG2细胞时，细胞活性与对照组比较明显降低（P＜0.05），若先用0.4 mmol/L的 NaHS预处理HepG2细胞后，其细胞活性显著升高（P＜0.05），见图2C。

2.3 升高肝细胞内H2S水平可以显著降低细胞内4-HNE与蛋白质形成的加合物水平 利用Western Blot技术检测肝细胞内4-HNE与蛋白质形成的加合物水平。结果表明，20μmol/L的4-HNE作用于HepG2肝细胞之后，细胞内4-HNE蛋白质加合物表达增加。用0.4 mmol/L NaHS预处理肝细胞2h后，再加入20 μmol/L的4-HNE孵育1 h，与4-HNE单独作用组比较，NaHS+4-HNE组细胞内4-HNE蛋白质加合物水平显著降低，见图3A和3B。

图2 补充NaHS（H2S前体）显著抑制4-HNE诱导的肝细胞死亡。A：不同浓度4-HNE对HepG2肝细胞增殖的影响。（★P＜0．05 vs UT，#P＜0．05 vs 20 μmol/L 4-HNE）；B：不同浓度NaHS对HepG2肝细胞增殖影响（★P＜0．05 vs UT，#P＜0．05 vs 4-HNE）

图3 升高肝细胞内H2S水平可以显著降低胞内4-HNE与蛋白质形成的加合物水平。A： 4-HNE与蛋白质形成的加合物水平；B： 4-HNE与蛋白质形成的加合物水平的条带灰度值统计（★P＜0．05 vs UT，#P＜0．05 vs 4-HNE）

3 讨论

肝脏是酒精代谢的主要人体器官，长期的酒精摄入会导致肝细胞发生氧化应激和脂质过氧化，4-羟基壬烯酸（4-HNE）是酒精诱导肝脏氧化应激的主要产物之一，在ALD的发生发展过程中起着至关重要的作用。长期大量饮酒可以导致肝脏活性氧族（ROS）增多，诱导氧化应激，生成的4-HNE通过与细胞内的核酸或蛋白质等生物大分子结合形成加合物，改变肝细胞生理状态和功能，进而诱发ALD。1997年，Paradis V等［4］首次报道慢性酒精性肝病患者体内的4-HNE与蛋白质形成的加合物的浓度明显高于正常人。其后临床研究﹑流行病学调查及动物实验均证实，酒精性肝病患者及长期酗酒人群的肝脏及血浆中的4-HNE浓度显著升高，其与蛋白质形成的加合物的浓度可能与ALD的严重程度相关［5-6］。上述研究结果表明，4-HNE是ALD发生发展过程中一个重要的致病因素，然而对于4-HNE如何诱导或加重ALD及其具体机制尚未明确，有待进一步研究。Sampey BP等［7］的研究证明4-HNE可以通过抑制细胞内的ERK﹑Akt等信号转导通路，诱导肝细胞死亡。而4-HNE是否还可以通过对蛋白质的表观遗传学修饰调控其他细胞信号转导通路引发或加剧酒精诱导的氧化应激和肝细胞死亡尚未见明确报道。

而H2S参与了多种与4-HNE相关疾病的防治。Zheng-Wei L等［8］发现抑制内源性H2S的合成可以增加活性氧以及氧化应激相关代谢物的产生，而机体补充外源性的H2S则可以降低活性氧以及氧化应激相关代谢物的产生，并具有一定的抗氧化应激作用。本研究发现，补充H2S前体NaHS后可检测到肝细胞内H2S水平显著升高。MTT法和LDH活性检测实验结果显示，H2S可以抑制4-HNE诱导的肝细胞死亡。由此，推测外源H2S可以抑制肝细胞死亡，然而H2S是否通过清除4-HNE来抑制肝细胞凋亡从而改善ALD尚不可知。

据报道，正常人血浆中4-HNE的生理浓度为0.3～0.7μmol/L，而ALD患者的血浆中4-HNE浓度显著增加，肝脏的局部细胞为了应对氧化应激，4-HNE浓度甚至可高达100μmol/L［9］。如何降低过量的4-HNE水平，使其恢复至正常水平，保持4-HNE在体内的动态平衡是防治ALD的关键。4-HNE与蛋白质结合形成4-HNE蛋白质加合物是4-HNE发挥病理作用的主要机制之一，本研究Western blot结果显示，4-HNE与蛋白质结合并不是某一特定分子量的条带，而是从15～200KDa之间均会形成4-HNE与蛋白质的加合物，故目前来看，4-HNE与蛋白质的结合并不是特定的，而是与细胞内的蛋白广泛结合，影响蛋白质的翻译后修饰。为观察外源H2S对肝细胞内4-HNE蛋白质加合物表达的影响，用0.4mmol/L H2S前体NaHS预处理肝细胞2h，再加入20μmol/L的4-HNE孵育1h后提取蛋白后进行Western Blot实验，结果显示4-HNE作用后细胞内4-HNE蛋白质加合物表达明显增强，而H2S可显著抑制其增加。

综上所述，长期摄入酒精引起肝细胞内4-HNE水平升高，而H2S的前体NaHS可以提高肝细胞内H2S水平，清除4-HNE与蛋白质形成的加合物，从而抑制4-HNE诱导的肝细胞死亡。这将为ALD的临床治疗提供新的策略，也为以4-HNE为靶点的新型药物研发提供重要的理论指导和依据。然而，H2S清除肝细胞内4-HNE的确切机制仍有待进一步研究。

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