肝素酶抑制剂对结肠癌细胞侵袭迁移及MMP-2、MMP-9表达的影响

李琨琨 吴慧丽

(郑州大学附属郑州中心医院消化内科，河南 郑州 450007)

常见的治疗结肠癌方法有手术治疗、放疗及化疗，由于结肠癌具有易转移、易复发、早期发病隐匿等特点，结肠癌仍然严重威胁人类生命健康〔1～4〕。肝素酶(Hpa)具有降解硫酸肝素多糖的作用，属于葡萄糖醛酸内切酶，而硫酸肝素多糖是血管基质和细胞外基质的主要成分之一，在肿瘤转移过程中发挥促进作用〔5〕。近年研究表明，OGT2115是Hpa的特异性抑制剂，能够抑制胆囊癌、乳腺癌等转移和侵袭〔6，7〕。目前OGT2115对结肠癌细胞迁移和侵袭能力的影响尚不清楚。本研究以结肠癌细胞为研究对象，通过噻唑蓝(MTT)法、细胞划痕实验、Transwell小室等实验技术手段探讨Hpa抑制剂OGT2115对结肠癌细胞迁移和侵袭能力的影响。

1 材料与方法

1.1材料 结肠癌细胞SW480购自郑州大学，基质金属蛋白酶(MMP)-2多克隆抗体、MMP-9多克隆抗体、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)单多克隆抗体和辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗均购自美国Proteintech公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度检测试剂盒购自北京天根公司；胎牛血清、RPMI1640、胰蛋白酶均购自美国Gibco；肝素酶抑制剂OGT2115购自美国Tocris Bioscience；Hpa活性检测试剂盒购自上海纪宁实业。

1.2细胞培养 取出保存在液氮中的SW48细胞，在37℃的水浴中融化，加入细胞培养液(含有10%胎牛血清，100 U/ml青霉素，0.1 mg/ml链霉素的RPMI1640)，1 000 r/min离心10 min，弃上清，加入细胞培养液悬浮细胞，接种到细胞培养瓶中，放在37℃，5%CO2培养箱中培养。待细胞融合度达到90%，吸除细胞培养液，加入0.25%的胰蛋白酶，消化2 min，1 000 r/min离心10 min，弃上清，加入细胞培养液，根据实验要求按照不同比例接种到细胞瓶中继续培养。

1.3MTT检测细胞增殖 取培养至对数期的SW480细胞，按照每孔加入4 000个细胞种植于96孔细胞培养板中，观察细胞贴壁后，将原来的细胞培养液吸除后，加入含有Hpa抑制剂OGT2115终浓度为0、1.0、2.0、4.0、8.0 μmol/L的细胞培养液，每个浓度梯度设置5个复孔。培养48 h后，在每个孔中加入MTT溶液20 μl(5 mg/ml)，孵育4 h后，将上清液吸除后，每孔加入150 μl的二甲基亚砜溶液，混匀10 min。酶标仪检测570 nm的光密度值(OD值)，实验重复3次，取均值。

1.4实验分组 SW480细胞分为对照组和实验组，对照组细胞不含肝素酶抑制剂OGT2115的细胞培养液培养，实验组细胞用含有6 μmol/L Hpa抑制剂OGT2115的细胞培养液培养。

1.5细胞划痕实验检测细胞迁移 实验开始前，用记号笔在6孔细胞培养板的背面每间隔0.5 cm进行划线。将培养至对数期的SW480细胞以每孔加入3×105个细胞接种至6孔细胞培养板，观察细胞融合度达到90%时，弃去细胞培养液，用移液枪枪头沿着标记的线划线，用磷酸盐缓冲液(PBS)将划下的细胞洗掉，按照对照组和实验组分组方法分别加入含有0、6 μmol/L OGT2115的不含胎牛血清的细胞培养液，继续培养48 h。记录0 h划痕宽度和48 h划痕宽度，计算细胞迁移率，实验重复3次，取均值。细胞迁移率=100%×(0 h划痕宽度-48 h划痕宽度)/0 h划痕宽度。

1.6Transwell小室检测细胞侵袭 取Matrigel胶与冰预冷的RPMI1640以1∶8的比例混合，每孔加入50 μl包被Transwell小室。取培养至对数期的SW480细胞，用胰蛋白酶消化后，1 000 r/min离心10 min，弃上清，按照对照组和实验组分组方法加入含有0、6 μmol/L OGT2115的不含有胎牛血清的细胞培养液悬浮细胞(浓度为2×105个/ml)，取200 μl加入小室的上室，在外室的24孔板中加入500 μl含有10%胎牛血清的细胞培养液，每组设置4个复孔，实验重复3次。培养48 h后，将小室取出，用90%的乙醇溶液固定10 min，用PBS洗涤后，1%的结晶紫染色后，在显微镜下随机选择5个视野，计算侵袭细胞数目。

1.7酶联免疫吸附法(ELISA)检测Hpa活性 对照组和实验组细胞按照1.4方法培养48 h后，收集培养液上清，用ELISA试剂盒检测培养液上清Hpa活性，计算Hpa活性变化的百分率，实验重复3次，取均值。

1.8Western印迹检测MMP-2、MMP-9表达 对照组和实验组细胞按照1.4中方法培养48 h后，按照细胞蛋白提取试剂盒提取细胞中的总蛋白。BCA蛋白浓度检测试剂盒检测蛋白浓度，取蛋白样品与4倍上样缓冲液按照3∶1的比例混合煮沸5 min。加入聚丙烯酰胺凝胶电泳上样孔中，每孔加入50 μg的变性蛋白样品。80 V电压电泳30 min后，观察溴酚蓝进入分离胶和浓缩胶的边缘时，调整为120 V电压继续电泳至结束。转膜：90 mA，4℃转膜70 min。封闭：5%脱脂奶粉封闭，37℃孵育2 h。一抗结合：800倍稀释，4℃，过夜。二抗结合：1 500倍稀释，37℃孵育1 h。滴加显色液，曝光，以GAPDH为内参，分析蛋白表达水平，实验重复3次，取均值。

1.9统计学方法 采用SPSS22.0软件进行单因素方差分析及t检验。

2 结 果

2.1细胞增殖检测结果 0、1.0、2.0、4.0、8.0 μmol/L Hpa抑制剂OGT2115作用后细胞OD值依：1.39±0.11、1.10±0.05、0.91±0.08、0.71±0.05、0.56±0.04。其半数抑制浓度为(5.82±0.34)μmol/L。Hpa抑制剂OGT2115能够呈浓度依赖的抑制结肠癌细胞增殖活力(P<0.05)。

2.2细胞迁移检测结果 图1所示，实验组细胞迁移率〔(25.11±1.32)%〕明显低于对照组〔(46.84±3.54)%〕，差异有统计学意义(t=9.962，P=0.001)，说明Hpa抑制剂OGT2115能够降低结肠癌细胞迁移能力。

2.3细胞侵袭检测结果 图2所示，实验组侵袭细胞数目〔(96.87±8.26)个〕明显低于对照组〔(153.24±11.84)个〕，差异有统计学意义(t=6.763，P=0.003)，说明Hpa抑制剂OGT2115能够降低结肠癌细胞侵袭能力。

图1 划痕实验检测细胞迁移率(×20)

图2 Transwell实验检测侵袭细胞(×40)

2.4Hpa活性检测结果 实验组Hpa活性〔(12.05±1.14)%〕明显低于对照组〔(26.35±1.58)%〕，差异有统计学意义(t=12.713，P=0.000)，说明Hpa抑制剂OGT2115能够降低结肠癌细胞Hpa活性。

2.5MMP-2、MMP-9表达检测结果 对照组和实验组MMP-2表达水平依次为：(0.76±0.08)、(0.25±0.04)，MMP-9表达水平依次为：(0.78±0.06)、(0.16±0.03)。实验组MMP-2(0.25±0.04)、MMP-9(0.16±0.03)表达水平明显低于对照组〔(0.76±0.08)、(0.78±0.06)〕，差异有统计学意义(t=9.876，P=0.001；t=16.008，P=0.000)，见图3，表明肝素酶抑制剂能够降低结肠癌细胞中MMP-2、MMP-9的表达。

图3 Western印迹检测MMP-2和MMP-9表达

3 讨 论

肿瘤的转移是一个极为复杂的过程，肿瘤细胞从原发病灶中分离出来以后，进入周围的组织中，穿过基底膜，进入淋巴管或者血管中进入周围组织中继续增殖形成转移灶〔8～10〕。硫酸肝素多糖是甘氨聚糖家族中的成员之一，含有多个可以被修饰的糖氨残基，通常情况下其以蛋白聚糖形式存在于细胞中，而细胞内的多个蛋白聚糖能够通过共价键的形式形成多肽核心〔11〕。纤维蛋白、胶原等在细胞表面和细胞基质中均广泛存在，并且在细胞黏附和特异性结合过程中发挥促进作用〔12〕。Hpa能够与硫酸肝素多糖特异性结合，从而发挥降解硫酸肝素多糖的作用，影响细胞的转移〔13〕。OGT2115是一种2，3-二氢-1，3-二氧-1H-异吲哚-5-羧酸化合物，能够特异性抑制Hpa的活性〔14〕。

近年研究表明，Hpa具有抗肿瘤作用，在肿瘤转移和生长过程中发挥抑制作用〔15〕。徐锦程等〔16〕的研究表明，0.4～6.4 μmol/L的Hpa抑制剂OGT2115能够抑制口腔鳞癌细胞的生长、迁移和侵袭，抑制作用随着作用浓度的升高而增大。付西峰等〔17〕通过体外细胞实验发现，Hpa抑制剂OGT2115能够降低胰腺癌细胞迁移率和侵袭细胞数目，并且对吉西他滨对胰腺癌的抗迁移和侵袭作用具有协同作用。这些研究结果均显示，Hpa抑制剂OGT2115在肿瘤转移和侵袭过程中发挥抑制作用。本研究与上述报道结果相符合，均说明Hpa抑制剂具有抗肿瘤细胞转移和侵袭的作用。

癌细胞的转移过程中，降解细胞外基质成分是关键步骤之一〔18〕。细胞外基质在维持细胞形态、细胞迁移、细胞分化等过程中发挥调控作用。MMP几乎能够将所有细胞外基质成分降解，在肿瘤细胞的迁移过程中发挥破坏组织学屏障的作用〔19，20〕。MMP-2和MMP-9是基质金属蛋白酶家族的成员之一，属于明胶酶类，在肿瘤基底膜降解过程中发挥促进作用〔21〕。本研究说明Hpa抑制剂可能通过抑制MMP-2、MMP-9的表达和Hpa的活性发挥抗肿瘤转移的作用。

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