miR-92a对H9C2心肌细胞增殖、凋亡及Wnt信号通路的影响

厉 菁 袁义强 张 宇 张 华 张传西 宣学习 王明杰

(郑州市第七人民医院心内科，河南 郑州 450006)

心肌细胞凋亡是引起各种慢性心力衰竭、心脏功能恶性的主要因素〔1〕。microRNA(miRNA)通过对其靶基因的表达调节，参与细胞增殖、凋亡、分化等生物学行为，也可参与多种疾病的发生发展〔2～4〕。miR-92a是miRNAs家族中的一员，有研究表明，miR-92a在诱导缺血后的组织中表达明显升高〔5〕，心肌梗死模型中抑制miR-92a的表达可降低心肌梗死面积、改善心肌梗死后重塑和新生血管形成，从而促进心脏功能的恢复〔6〕。关于miR-92a对过氧化氢(H2O2)诱导的心肌细胞增殖凋亡的影响尚未清楚。本研究将miR-92a的抑制物(inhibitor)转染H2O2诱导的H9C2心肌细胞，检测心肌细胞的增殖凋亡情况及其作用机制。

1 材料与方法

1.1细胞株及主要试剂和仪器 大鼠心肌细胞H9C2购自中国科学院上海细胞库；胎牛血清、DMEM培养基均购自美国Hycloneo公司；B细胞淋巴瘤/白血病(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、β-连环蛋白(β-catenin)、c-Myc抗体均购自美国Epitmics公司；H2O2、细胞增殖及毒性检测(CCK8)试剂盒、膜联蛋白(Annexin)V-异硫/碘化丙锭(PI)细胞凋亡试剂盒均购自中国碧云天试剂公司；二喹啉甲酸(BCA)试剂盒购自Thermo公司；Trizol、荧光定量-PCR试剂盒均购自日本TAKARA公司；酶标仪购自美国Bio Tek公司；实时荧光定量(RT)-PCR仪购自瑞士Roche；流式细胞仪购自美国Bio-Rad公司。

1.2细胞培养 取出在液氮罐中保存的H9C2心肌细胞，置于37℃水浴锅中快速融化，用含有10%胎牛血清的DMEM培养基，置于37℃、5% CO2培养箱中培养。细胞达到80%～90%融合生长时，弃去旧的培养液，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞3次，胰蛋白酶消化细胞，细胞由梭形变为圆形时倒掉胰蛋白酶，加入培养基终止消化。根据实验需要传代。实验为生长至对数期的细胞。

1.3实验分组及细胞转染 H9C2细胞分为空白对照组、阴性对照组、miR-92a inhibitor组。空白对照组不经特殊处理，阴性对照组和miR-92a inhibitor组通过LipofectamineTM2000(美国，Invitrogen 公司)转染至H9C2细胞中，转染浓度均为200 nm，转染6 h后换成含有10%胎牛血清的DMEM培养基，置于37℃、5% CO2培养箱培养48 h，收集细胞。

1.4RT-PCR检测H9C2心肌细胞中miR-92a的表达 收集转染48 h的细胞，利用Trizol法提取细胞中的总RNA，并检测RNA的纯度，逆转录为cDNA，以U6作为内参基因，cDNA为模板进行RT-PCR，根据Ct值，通过2-△△Ct法对miR-92a的表达进行定量分析。实验重复3次。

1.5CCK8实验检测细胞增殖 实验分为空白对照组、H2O2组(200 μmol/L的H2O2处理细胞6 h)和miR-92a inhibitor+H2O2组(细胞中转染miR-92a inhibitor，转染48 h后用200 μmol/L的H2O2处理细胞6 h)。取生长至对数期的H9C2心肌细胞，以每孔1×104个细胞接种在96孔板中，置于37℃、5% CO2培养箱培养12 h以上，观察细胞是否贴壁，在贴壁均匀的96孔板中按照上述分组加入至细胞，处理完毕后收集细胞，每孔细胞中加入CCK8试剂10 μl，37℃继续培养2 h，震荡5 min后，酶标仪于570 nm波长处测定吸光度(OD)值。

1.6流式细胞仪检测细胞凋亡 收集按照1.5分组处理完毕的3组细胞，PBS洗涤细胞3次，胰蛋白酶消化细胞，细胞由梭形变圆时，加入培养基终止消化，将细胞吹打成细胞悬液，离心，弃掉上清，PBS洗涤细胞，再次离心，收集(1～5)×105细胞，加入500 μl结合缓冲液悬浮细胞，在分别加入Annexin V-FITC和PI各5 μl(浓度250 μg/ml)，室温避光反应5～15 min，在1 h内上流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.7Bcl-2、Bax、β-catenin、c-Myc蛋白表达检测 收集按照1.5分组处理完毕的3组细胞，加入裂解液裂解细胞30 min，收集蛋白并用BCA试剂盒测定蛋白浓度，蛋白样品煮沸变性5 min，上样，每泳道40 μg蛋白样品经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)电泳分离1～2 h，后转至硝酸纤维素膜，5%的脱脂奶粉封闭2 h，4℃孵育Bcl-2、Bax、β-catenin、c-Myc一抗(皆按照1∶1 000稀释)过夜，次日加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗，室温孵育1 h，增强型化学发光法(ECL)进行显色，显影后采用Gel-Pro analyzer分析各个条带的光密度，

1.8统计学方法 应用SPSS21.0软件进行单因素方差分析、t检验。

2 结 果

2.1转染效果检测 miR-92a inhibitor组miR-92a mRNA表达(0.311±0.021)显著低于空白对照组(1.000±0.031，P<0.05)，阴性对照组(0.964±0.045)与空白对照组差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2抑制miR-92a表达对H2O2诱导的H9C2心肌细胞增殖的影响 与空白对照组(OD值，0.43±0.35)比较，H2O2组(0.17±0.18)细胞增殖显著降低，与H2O2组比较，miR-92a inhibitor+H2O2组(0.30±0.24)显著升高(均P<0.05)。

2.3抑制miR-92a表达对H2O2诱导的H9C2心肌细胞凋亡的影响 与空白对照组比较，H2O2组细胞凋亡率及Bax蛋白表达均显著升高，Bcl-2蛋白表达显著降低(P<0.05)，与H2O2组比较，miR-92a inhibitor+H2O2组细胞凋亡率及Bax蛋白表达均显著降低，Bcl-2蛋白表达显著升高(P<0.05)。见表1。

表1 抑制miR-92a表达对H2O2诱导的H9C2心肌细胞凋亡率及Bcl-2和Bax表达的影响

与空白对照组比较：1)P<0.05；与H2O2组比较：2)P<0.05

2.4抑制miR-92a表达对H2O2诱导的H9C2心肌细胞Wnt/β-catenin信号通路的影响 与空白对照组(0.138±0.015，0.105±0.010)比较，H2O2组β-catenin和c-Myc蛋白表达(0.662±0.057，0.341±0.032)均显著升高(P<0.05)，与H2O2组比较，miR-92a inhibitor+H2O2组(0.357±0.039，0.173±0.019)均显著降低(P<0.05)。

3 讨 论

研究发现，癌症、内分泌疾病、心血管疾病等的发生发展受到miRNA的调控，心血管疾病氧化损伤也受到miRNA的调控〔7〕。研究发现，经H2O2处理的大鼠心肌细胞中miR-181a表达上调，抑制miR-181a的表达可降低H2O2诱导的心肌细胞的凋亡〔8〕；H2O2处理的大鼠心肌细胞中miR-139表达降低，过表达miR-139可降低H2O2诱导的心肌细胞的凋亡〔9〕。miR-92a是miRNAs家族中的一员，有研究发现，心肌缺血再灌注损伤可引起细胞内miR-92a的表达升高〔10〕，提示miR-92a的高表达可使心肌缺血再灌注损伤加重，有研究也发现miR-92a参与了心肌梗死后的心脏重塑〔11〕。细胞凋亡受到细胞内抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白的调节，细胞的凋亡发生是这两类相互拮抗的蛋白间失衡的结果。Bcl-2家族在各种刺激引起的细胞凋亡中有关键作用，Bax和Bcl-2分别是Bcl-2家族的促凋亡和抑凋亡基因，能通过控制线粒体凋亡通过，诱导细胞的凋亡〔12〕。有研究表明，Bcl-2和Bax表达水平的高低与凋亡调控直接相关，Bcl-2降低，Bax增高，促进细胞凋亡，反之抑制细胞凋亡〔13〕。本研究提示miR-92a可通过调节Bcl-2和Bax表达影响心肌细胞凋亡。在正常情况下，Wnt信号通路是沉默的，在各种病理状态下被激活〔14〕。一项体外研究发现，在缺血缺氧状态下的小鼠心肌组织，Wnt信号通路被过度激活，从而使心肌细胞凋亡增加〔15〕。也有研究发现，抑制Wnt信号通路可减轻心肌梗死面积，降低心肌细胞凋亡，改善心功能〔16〕。本研究结果提示miR-92a可通过Wnt信号通路影响心肌细胞凋亡。miR-92a可能成为一个潜在的治疗心肌疾病的作用靶点。

4 参考文献

1Barile L,Lionetti V,Cervio E,etal.Extracellular vesicles from human cardiac progenitor cells inhibit cardiomyocyte apoptosis and improve cardiac function after myocardial infarction〔J〕.Cardiovasc Res,2014;103(4):530-41.

2Mao J,Lv Z,Zhuang Y.MicroRNA-23a is involved in tumor necrosis factor-α induced apoptosis in mesenchymal stem cells and myocardial infarction〔J〕.Exp Mol Pathol,2014;97(1):23-30.

3孙启玉,贾兴旺,田亚平.动脉粥样硬化斑块钙化与 microRNA〔J〕.中国老年学杂志,2015;35(16):4724-8.

4García R,Nistal JF,Merino D,etal.p-SMAD2/3 and DICER promote pre-miR-21 processing during pressure overload-associated myocardial remodeling〔J〕.Biochim Biophy Acta,2015;1852(7):1520-30.

5Jiang C,Ji N,Luo G,etal.The effects and mechanism of miR-92a and miR-126 on myocardial apoptosis in mouse ischemia-reperfusion model〔J〕.Cell Biochem Biophys,2014;70(3):1901-6.

6Zhang C,Wu W,Wang C,etal.Expression and function of miR-92a in ventricular remodeling after PCI treatment of acute myocardial infarction〔J〕.Int J Clin Exp Pathol,2017;10(2):1158-65.

7Wronska A,Kurkowska-Jastrzebska I,Santulli G.Application of microRNAs in diagnosis and treatment of cardiovascular disease〔J〕.Acta physiologica,2015;213(1):60-83.

8Zhu J,Yao K,Wang Q,etal.Circulating miR-181a as a potential novel biomarker for diagnosis of acute myocardial infarction〔J〕.Cell Physiol Biochem,2016;40(6):1591-602.

9Yang X,Yu H,Hu H,etal.MiR-139-3p is related to left ventricular hypertrophy and cardiomyocyte apoptosis in two-kidney one-clip hypertensive rats〔J〕.Archiv Biolog Sci,2015;67(2):427-35.

10Wang Y,Men M,Yang W,etal.MiR-31 downregulation protects against cardiac ischemia/reperfusion injury by targeting protein kinase C epsilon (PKCε) directly〔J〕.Cell Physiol Biochem,2015;36(1):179-90.

11Boon RA,Dimmeler S.MicroRNAs in myocardial infarction〔J〕.Nat Rev Cardiol,2015;12(3):135-42.

12顾 万,赵新阁,张 幸.芒柄花黄素通过调节 Bax 和 Bcl-2 蛋白表达诱导 SKOV3 细胞凋亡〔J〕.四川生理科学杂志,2014;36(2):60-2.

13Al-Fatlawi AA,Al-Fatlawi AA,Irshad M,etal.Rice bran phytic acid induced apoptosis through regulation of Bcl-2/Bax and p53 genes in HepG2 human hepatocellular carcinoma cells〔J〕.Asian Pac J Cancer Prev,2014;15(8):3731-6.

14季 红,高 青,胡先同,等.经典 Wnt 信号通路在心肌细胞分化作用的研究进展〔J〕.天津中医药大学学报,2014;33(4):246-8.

15Huang HM,Huang CC,Wang FS,etal.Activating the Wnt/β-catenin pathway did not protect immature retina from hypoxic〔J〕.Invest Ophthalmol,2015;56(8):4300-8.

16Yu H,Zhao XX,Shan XH,etal.Effect of thioredoxin-interacting protein on Wnt/β-catenin signaling pathway and diabetic myocardial infarction〔J〕.Asian Pacific J,2015;8(11):976-82.