血清雌激素水平和miR-365表达水平在非小细胞肺癌患者中的变化及其相关性研究

李树坡，李鹏，余捍东，赵晶

肺癌是居于我国城镇居民发病率第一位的恶性肿瘤，其发病率和病死率一直呈上升的趋势，其中非小细胞肺癌（NSCLC）约占85%［1］。研究报道，NSCLC患者血清雌激素水平高于其他类型肺癌和正常人群［2］，经抗雌激素治疗可显著提高患者的生存率，提示血清雌激素水平在NSCLC的发生发展中可能发挥重要作用［3］。研究表明，微小RNA（miRNA）与肿瘤的发生发展、侵袭转移等密切相关，其表达水平在肿瘤中表现为上调或者下调，同时伴随相关功能的改变，提示miRNA在肿瘤的诊断和治疗中具有较大的应用前景［4］。在与血清雌激素水平相关的肿瘤（乳腺癌）中，miR-365表达水平发生变化，并且与血清雌激素水平存在关联［5］。与血清雌激素水平关系密切的NSCLC、miR-365表达水平如何，是否存在与乳腺癌类似的变化尚未见相关报道。本研究通过分析NSCLC患者血清雌激素水平与miR-365表达水平的变化及其相关性，以期为NSCLC的早期诊断和治疗提供新的思路。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2015年3月—2016年4月在三峡大学附属仁和医院接受原发性NSCLC手术切除的57例患者作为NSCLC组，其中男35例，女22例；年龄47～73岁，平均年龄（59.5±5.8）岁；病理类型：腺癌31例，鳞状细胞癌22例，腺鳞癌4例；TNM分期按照国际肺癌研究会（IASLC）公布的标准［6］，其中Ⅰ～Ⅱ期33例，Ⅲ～Ⅳ期24例。纳入标准：为初次发现并在本院接受治疗。排除标准：既往有内分泌、女性生殖系统疾病和其他系统肿瘤。选取同期本院体检中心体检健康者50例作为对照组，其中男38例，女12例；年龄46～70岁，平均年龄（57.7±6.4）岁。对照组经检查均无肝、肺、肾、脑等疾病，无消化道和血液系统疾病史。本研究经三峡大学附属仁和医院医学伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

1.2 试剂与仪器 雌二醇ELISA检测试剂盒（美国Linco Research公司）；miScript反转录试剂盒与miScript SYBR Green PCR试剂盒（QIAGEN公司）；Trizol-LS（美国Invitrogen公司）；Smart Spec plus核酸蛋白检测仪（美国 Bio-Rad公司）；Light Cycler 480Ⅱ基因扩增检测仪（德国Roche公司）；引物由上海生工生物技术服务有限公司合成并修饰。

1.3 研究方法

1.3.1 一般资料收集 收集对照组性别、年龄，收集NSCLC组性别、年龄、吸烟（吸烟定义为20支/d，持续10年）情况、组织学类型、分化程度、TNM分期、淋巴结转移情况。

1.3.2 检测血清雌激素水平 研究对象于清晨空腹抽静脉血3～5 ml，3 000 r/min离心10 min（离心半径5 cm），分离血清，吸取上清液后迅速置于-80 ℃冰箱保存。采用ELISA法检测研究对象血清雌二醇水平，即血清雌激素水平。

1.3.3 实时荧光定量PCR（Real-time PCR）法检测miR-365表达水平 采用Trizol-LS提取外周血中总RNA，采用miScript反转录试剂盒进行反转录成cDNA，用Smart Spec plus核酸蛋白检测仪检测OD260/280，计算miRNA的含量及纯度。cDNA样本置于-20 ℃冰箱保存备用。miR-365上游引物为5'-UAAUGCCCCUAAAAAUCCUUAU-3'，下游引物为5'-AAGGAUUUUUAGGGGCAUUAUU-3'；内参U6的上游引物为 5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物为5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。配成 25 μl反应体系，不足部分用H2O 补齐。Light Cycler 480Ⅱ基因扩增检测仪设置的反应参数：95 ℃预变性1 min，95 ℃变性30 s，68 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环。采用相对标准曲线法计算miR-365表达水平，所有样品均做3个复孔。

1.4 统计学方法 采用SPSS 15.0软件进行数据分析。计量资料以表示，两组间比较采用两独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；血清雌激素水平与miR-365表达水平的相关性分析采用Pearson相关分析；计数资料比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组性别、年龄比较 两组研究对象性别、年龄比较，差异无统计学意义（χ2=1.89，P=2.38；t=1.35，P=0.18）。

2.2 血清雌激素水平比较 NSCLC组血清雌激素水平为（145±49）pmol/L，其中男性患者为（127±35）pmol/L，女性患者为（165±63）pmol/L；对照组血清雌激素水平为（87±38）pmol/L。NSCLC组血清雌激素水平高于对照组，差异有统计学意义（t=2.73，P=0.01）。在NSCLC组中，男性患者血清雌激素水平与女性患者比较，差异无统计学意义（t=1.87，P=0.07）。

2.3 两组miR-365表达水平比较 NSCLC组miR-365表达水平为（0.57±0.43），对照组为（1.15±0.48）。NSCLC组miR-365表达水平低于对照组，差异有统计学意义（t=2.65，P=0.02）。

2.4 不同特征NSCLC患者miR-365表达水平比较不同性别、年龄、吸烟情况NSCLC患者miR-365表达水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。不同组织学类型NSCLC患者miR-365表达水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；鳞状细胞癌、腺鳞癌NSCLC患者miR-365表达水平高于腺癌，差异有统计学意义（P＜0.05）。不同分化程度NSLCL患者miR-365表达水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；低分化NSCLC患者miR-365表达水平低于高分化，差异有统计学意义（P＜0.05）。TNM分期为Ⅰ～Ⅱ期的NSCLC患者miR-365表达水平高于Ⅲ～Ⅳ期，差异有统计学意义（P＜0.05）。有淋巴结转移的NSCLC患者miR-365表达水平低于无淋巴结转移，差异有统计学意义（P＜0.05，见表1）。

2.5 NSCLC组血清雌激素水平与miR-365表达水平的相关性 NSCLC组血清雌激素水平与miR-365表达水平呈负相关（r=-0.57，P=0.02）。

3 讨论

肺癌是非内分泌相关肿瘤，但越来越多的研究发现，血清雌激素水平与肺癌的发生发展存在关联［2］。已有研究证实，血清雌激素水平可通过调节c-myc、c-fos等基因的表达，促进转化生长因子、胰岛素样生长因子Ⅱ、与细胞周期有关的调节蛋白的表达，减少肿瘤抑制性生长因子的合成等多种途径参与肺癌的发生发展［7-8］。本研究结果显示，NSCLC组血清雌激素水平高于对照组，提示血清雌激素水平可能在NSCLC的发生发展中发挥作用，与其他研究结果一致［3，9］。HSU等［9］的研究发现，NSCLC患者血清雌激素水平较同性别正常对照人群显著升高，而在NSCLC患者间无性别差异；CHE等［3］的研究也表明NSCLC患者经过抗雌激素治疗后，可以显著提高顺铂治疗的依从性，表明血清雌激素水平升高与NSCLC的发生发展及转归存在关联。

miRNA是一组具有21～25个碱基对的内源性非编码单链RNA，且核苷酸序列高度保守，参与调节细胞的生长、增殖、分化和凋亡等活动［10］。多项研究表明，miRNA在肿瘤组织中表现出特异性的表达失调现象，这一现象为肿瘤的诊断和治疗提供了新的思路［11-12］。研究表明，miR-365参与抑制肿瘤增殖、侵袭和转移等过程［13］。本研究结果显示，NSCLC组miR-365表达水平低于对照组，不同组织学类型、分化程度、TNM分期、淋巴结转移情况患者miR-365表达水平间有差异，预示着miR-365可能参与了疾病的发展过程或者是疾病发展的观测指标。研究证实，在胃癌中miR-365 主要通过作用于靶分子cyclin D1和CDK4 /6而调控细胞周期，从而抑制肿瘤细胞增殖［14］。KANG等［15］的研究也证实miR-365表达水平与甲状腺转录因子NKX2-1呈负相关，而NKX2-1是调控细胞增殖的重要靶点，同时，转染miR-365 模拟剂后发现能够有效地抑制肿瘤细胞的增殖，而miR-365抑制剂却能使肿瘤细胞少量增殖。

表1 不同特征NSCLC患者miR-365表达水平比较Table 1 Comparison of expression level of miR-365 in NSCLC patients with different characteristics

表1 不同特征NSCLC患者miR-365表达水平比较Table 1 Comparison of expression level of miR-365 in NSCLC patients with different characteristics

注：与腺癌比较，aP＜0.05；与高分化比较，bP＜0.05；c为F值

项目 例数 miR-365表达水平 t（F）值 P值性别男35 0.52±0.38 1.18 0.28女22 0.62±0.41年龄（岁）＜60 18 0.67±0.42 1.07 0.36≥60 39 0.43±0.26吸烟情况有33 0.61±0.39 1.16 0.31无24 0.49±0.41组织学类型腺癌 31 0.27±0.19 3.51c ＜0.01鳞状细胞癌 22 0.77±0.51a腺鳞癌 4 0.91±0.35a分化程度高分化 6 0.87±0.28 2.07c 0.04中分化 33 0.59±0.43低分化 18 0.37±0.31b TNM分期Ⅰ～Ⅱ期 33 0.87±0.23 2.63 0.01Ⅲ～Ⅳ期 24 0.31±0.19淋巴结转移无转移 26 0.77±0.35 2.27 0.03有转移 31 0.36±0.28

虽然miR-365表达水平在乳腺癌中的变化已有文献报道［5］，但在肺癌中的表达情况及其与血清雌激素水平的关联尚未见相关报道。本研究结果发现，NSCLC组血清雌激素水平与miR-365表达水平呈负相关，这表明NSCLC的发生发展可能与血清雌激素水平及其调控因子有关，但血清雌激素水平的变化与miRNA表达异常的因果关系如何，值得进一步研究。

本研究虽然观察到血清雌激素水平和miR-365表达水平与NSCLC的肿瘤生物学特征存在一定关系，但是也存在样本量偏小、观察追踪时间短等不足。后续研究中，在扩大样本量的同时，增加对患者的观察时间，进一步明确两者的关联，将为NSCLC的早期诊断或疗效观察提供新的选择。

综上所述，NSCLC患者血清雌激素水平高于正常人群，miR-365表达水平低于正常人群，且两者具有相关性，可为NSCLC患者的早期诊断和治疗提供新的思路。

作者贡献：李鹏进行试验设计与实施、撰写论文并对文章负责；余捍东、赵晶进行资料收集整理、试验实施与评估、资料收集；李树坡进行质量控制及审校。

本文无利益冲突。

［1］GUO P，HUANG Z L，YU P，et al．Trends in cancer mortality in China：an update［J］．Ann Oncol，2012，23（10）：2755-2762．DOI：10.1093/annonc/mds069.

［2］王威，马清峰.老年肺癌患者性激素水平的变化及意义［J］．中国老年学杂志，2016，36（5）：1223-1224．DOI：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.05.094.WANG W，MA Q F.Significance of sex hormone alteration in elder lung cancer patient［J］．Chinese Journal of Gerontology，2016，36（5）：1223-1224．DOI：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.05.094.

［3］CHE Y，SUN X，HUANG C，et al．Influence of tamoxifen or the combination of tamoxifen and cisplatin on the growth of human lung adenocarcinoma A549 cells［J］．Oncology and Translational Medicine，2014，13（11）：523-527．DOI：10.1007/s10330-014-0034-z/mds069.

［4］王鹤，刘志利，德伟，等．microRNA-335对人非小细胞肺癌细胞迁移、侵袭及增殖能力的影响［J］．南京医科大学学报：自然科学版，2012，32（6）：795-799.

［5］YAN L X，HUANG X F，SHAO Q，et al．MicroRNA miR-21 overexpression in human breast cancer is associated with advanced clinical stage，lymph node metastasis and patient poor prognosis［J］．RNA，2008，14（11）：2348-2360．DOI：10.1261/rna.1034808.

［6］CHANSKY K，SCULIER J P，CROWLEY J J，et al．国际肺癌研究会分期项目 采用外科治疗的非小细胞肺癌的预后因素和病理TNM分期［J］．杨永波，李志刚，译.中国肺癌杂志，2010，13（1）：9-18.DOI：10.3779/j.issn.1009-3419.2010.01.02.CHANSKY K，SCULIER J P，CROWLEY J J，et al．The international association for the study of lung cancer staging project prognostic factors and pathologic TNM stage in surgically managed non-small cell lung cancer［J］．YANG Y B，LI Z G，translation.Chinese Journal of Lung Cancer，2010，13（1）：9-18．DOI：10.3779/j.issn.1009-3419.2010.01.02.

［7］陈名声，徐焰，郝晓柯，等．血清性激素的水平对男性肺癌患者诊断的意义［J］．中国肺癌杂志，2005，8（4）：300-303.CHEN M S，XU Y，HAO X K，et al．The significance of serum sexual hormones' level in male patients with lung cancer［J］．Chinese Journal of Lung Cancer，2005，8（4）：300-303.

［8］徐袁秋，许会军.非小细胞肺癌患者血清性激素的变化［J］．河 北 医 药，2011，33（20）：3050-3052．DOI：10.3969/j.issn.1002-7386.2011.20.004.XU Y Q，XU H J.The changes of serum sex hormones in patients with non-small-cell lung carcinoma［J］．Hebei Medical Journal，2011，33（20）：3050-3052．DOI：10.3969/j.issn.1002-7386.2011.20.004.

［9］HSU L H，LIU K J，TSAI M F，et al．Estrogen adversely affects the prognosis of patients with lung adenocarcinoma［J］．Cancer Sci，2015，106（1）：51-59．DOI：10.1111/cas.12558.

［10］WILLIAMS A E.Functional aspects of animal microRNAs［J］．Cell Mol Life Sci，2008，65（4）：545-562．DOI：10.1007/s00018-007-7355-9.

［11］WANG J，WANG X，WU G，et al．MiR-365b-3p，downregulated in retinoblastoma，regulates cell cycle progression and apoptosis of human retinoblastoma cells by targeting PAX6［J］．FEBS Lett，2013，587（12）：1779-1786．DOI：10.1016/j.febslet.2013.04.029.

［12］SINGH R，SAINI N.Downregulation of BCL2 by miRNAs augments drug-induced apoptosis——a combined computational and experimental approach［J］．J Cell Sci，2012，125（Pt 6）：1568-1578．DOI：10.1242/jcs.095976.

［13］高琳，王建宇，丁振华.miR-365在肿瘤中的研究进展［J］．生 命 科 学 研 究，2015，19（1）：91-94．DOI：10.16605/j.cnki.1007-7847.2015.01.018.

［14］郭水龙，朱圣韬，程芮，等．miR-365通过靶向E2F2抑制胃癌细胞增生和肿瘤形成［J］．首都医科大学学报，2016，37（1）：1-5．DOI：10.3969/j.issn.1006-7795.2016.01.001.GUO S L，ZHU S T，CHENG R，et al．miR-365 inhibited the proliferation and tumorigenicity of gastric cancer cells by targeting E2F2［J］．Journal of Capital Medical University，2016，37（1）：1-5．DOI：10.3969/j.issn.1006-7795.2016.01.001.

［15］KANG S M，LEE H J，CHO J Y.MicroRNA-365 regulates NKX2-1，a key mediator of lung cancer［J］．Cancer Lett，2013，335（2）：487-494．DOI：10.1016/j.canlet.2013.03.006.

（收稿日期：2017-12-11；修回日期：2018-02-21）

（本文编辑：刘新蒙）