实验动物微生物污染的人工净化

李秀荣

(中国医学科学院血液病医院（血液学研究所），天津 300020)

0 引言

在科研工作中，实验动物包括模式动物是我们研究人员的重要工具，大家对使用的实验动物的要求也从普通级别（conventional animal,CV）上升到SPF级别（specific pathogen free animals），即无特定病原体实验动物[1]。这些SPF级别实验动物不含人畜共患的病原体，而且同样不携带其它病毒、细菌以及支原体和衣原体等各种微生物和寄生虫，遗传背景清楚。但是在实际的繁殖、饲养和运输中过程中，可能会接触到各种病原微生物和寄生虫，这些微生物和寄生虫会对实验动物自身的健康产生威胁，也同样会对科研数据产生意想不到的干扰。所以通过各种方法对实验动物进行微生物的净化显得尤为重要[2]。比较可行的方法有剖腹取胎技术和胚胎移植技术，两种方法都是常用的微生物净化技术，前者是最简单而有效的手段；后者对转基因动物的微生物净化具有很好的优势[3]。

1 实验动物微生物净化的理论基础和技术可行性

净化是将实验动物中一些特定的病原微生物清除，使实验动物达到一定清洁级别的方法。实验动物的净化首先是获得无菌动物，而获得无菌动物主要有剖腹取胎和胚胎移植两个国际上公认的比较理想的种群净化方法[4]。

1.1 微生物净化的理论基础

在实验研究过程中，保持数据的可靠性、可复制性和科学性是实验开展的基础。在实验过程中实验动物往往会因为一些不可控因素而产生“污染”，例如外在微生物的污染以及内在遗传漂变和遗传污染。为防止这些的“污染”对实验结果产生影响，必须对实验动物进行净化，以保证在实验动物质量的可靠性和安全性。这种净化是针对所有已知的病原微生物包括一些未知的可能对实验动物造成伤害的微生物[5]。微生物的传播可以根据方式不同，分为水平和垂直两个方面，其中垂直传播是指母子的方式，这种方式是先天性的；水平传播是指外界环境的病原微生物通过各种方式影响着实验动物，这是后天带来的威胁。在这里必须强调，胎生动物的胎儿未离开胎盘以及卵生动物的卵未破壳，这样的情况只有垂直传播的可能性。胎盘屏障不仅是动物进化过程的自我保护，也在微生物净化中起着隔离的作用。垂直传播还有一个重要特点是只有母体动物在病毒血症或者菌血症等情况下，垂直传播可以进行下去，而且也不是每个幼体都是百分之百的感染，这是进行净化的重要基础。

1.2 微生物净化的技术可行性

1.2.1病原微生物的检测水平目前的技术水平发展迅速，已经有很多的检测手段和方法对各种病原微生物进行监测，有针对寄生虫检测的酶联免疫吸附实验（ELISA）、免疫荧光技术等；有针对细菌检测的分离培养法和PCR法；有针对病毒检测的血清ELISA法、PCR法等。现在随着技术的进步，很多种简易试剂盒也应运而生。只是这种监测是与目前的科学认知水平相接近的，以后随着科技的发展，还会不断得到加深[7]。

1.2.2剖腹取胎和胚胎移植的无菌手术操作。由于自然分娩的产道与外界相通，是污染的环境，所以胎生动物或者卵生动物都需要在无菌的情况下取出胎儿或者卵。目前不管是无菌的子宫切除取胎还是剖腹取胎都是可以达到的[8]。

2 实验动物微生物净化的案例

微生物净化主要有剖腹取胎方法和胚胎移植技术两种，这里主要介绍剖腹取胎方法。胎盘是天然的隔离各种微生物的有效屏障，采取无菌剖腹产手术，可以切断动物母子垂直的疾病传播，是微生物净化最简单和最有效的手段之一[10]。该方法需要人为控制交配时间，在进行子宫切除取胎或者剖腹取胎后要明白每种动物不同的生理特性，根据不同动物妊娠时间，预留无菌手续取胎和无菌孵化时间。常用实验动物妊娠期时间长短如下表1所示；还要注意每种动物不同的哺乳期和喂养次数以及断乳时间（表2所示），以期很好的喂养实验用动物幼崽[11]。

表1 常用实验动物妊娠期

下面简单介绍小鼠的剖腹产净化手术以及喂养过程。

2.1 妊娠期和剖腹产时间确定

随机选择10只雄鼠和20只雌鼠进行配种，检查阴栓判断是否配种成功，记录阴栓时间并分笼饲养；根据上述表1的妊娠时间，发现阴道处于开口状态，手指触摸到胎儿的头和腰大小类似时候，可以进行剖腹产手术[12]。

表2 常用实验动物哺乳期以及每日哺乳次数和断乳时间

2.2 剖腹产手术

剖腹产手术一定要保证绝对的无菌环境。手术的器械（止血钳、剪刀等）、纱布等事先经过高压灭菌；手术室提前进行紫外线照射消毒；断颈椎处死母鼠，放在提前预热至37度的2%过氧乙酸中进行表面消毒，而后将小鼠置于解剖盘，剪开腹部皮肤，将子宫暴露，先用止血钳固定住子宫颈，剪断子宫后放置预热至37度的2%过氧乙酸中浸泡消毒2s，用生理盐水冲洗干净，最后打开子宫取出仔鼠。采用人工乳或者提前准备好的代乳喂养[13]。

实验中20只雌鼠，成功受孕分娩的小鼠有14只，它们各自的妊娠时间如下表3所示，最短时间是18天，最长时间是20天。

表3 小鼠妊娠期

2.3 代乳母鼠喂养

在有净化的无菌动物的前提下，优先选择母乳代乳。代乳母鼠的选择遵照品系相同、健康、产过一胎，有哺乳经验，而且仔鼠成活率高的原则，代乳小鼠的产期和剖腹取胎的时间要接近，一般在剖腹产小鼠之前1-2天分娩，将剖腹产小鼠粘上代乳小鼠的粪便或者垫料进行染味，由代乳小鼠进行哺乳[14]。我们采用代乳方式，仔鼠的存活率为100%。

2.4 注意事项

第一，要保证环境以及所用的器具无菌，杜绝人为带入污染。第二，在处死剖腹母鼠-取子宫-剥离胎儿等步骤要一气呵成，速度要快，避免胎儿长时间离开母体，造成窒息死亡。第三，要根据实验动物的生理特征，计算好妊娠时间和剖腹的时间，并且结合手指触诊的经验，确定剖腹的时间，剖腹太早可能由于仔鼠发育未成熟导致成活率降低；太晚剖腹又有剖腹小鼠提前自然分娩的可能。第四，在进行剖腹手术过程中，接近室温的温度是保证手术成功的重要因素，过高或过低的温度都不利于仔鼠的存活[15]。最后，对剖腹产的仔鼠进行染味时候，一定要充分，避免代乳母鼠不饲喂哺乳。

3 结语

实验动物的微生物净化是一个连续的过程，上述提到的剖腹产净化是其中的一个步骤，制备好的净化动物还需要不断的繁殖，在这个过程中，饲养环境也显得尤为重要，实验动物设施的隔离屏障系统是防止动物感染的一道重要屏障，现在动物实验都有洁净的IVC系统，但是操作人员的合规操作很重要，需要严格按照无菌操作规程进行实验动物的饲养，同时要定期检查动物饲养系统的各种指标，以防整个系统出现故障，造成实验动物大规模的发生微生物的污染。

[1] 赵继勋.实验动物的微生物及寄生虫净化[J].实验动物科学,2011,28(4):67-70.

[2] 吴思奡,王箐,高昌,等.实验用斑马鱼主要疾病及其实验动物标准化研究过程面临的主要问题[J].实验动物科学,2009,26(4):51-56.

[3] 黄瑾.生物净化技术用于重建SPF级日本大耳兔生产群[D].上海交通大学,2014.

[4] 戴方伟,萨晓婴,周莎桑,等.Z:ZCLA长爪沙鼠生物净化前后微生物携带情况的比较研究[C].华东地区第十二届实验动物科学学术交流会论文集,2012:71-77.

[5] 戴琦.利用胚胎移植及相关技术培育实验用SPF小型猪[D].西北农林科技大学,2008.

[6] 叶明霞,孔利佳.胚胎移植术进行基因修饰小鼠的生物净化[C].//中国西部第十二届实验动物管理与学术研讨会论文集,2013:104-106.

[7] 隋世燕,苏晶晶.剖腹取胎和胚胎移植技术在实验动物净化方面的研究进展[J].畜禽业,2009,(6):12-13.

[8] 徐艺玫,王新国,史深,等.封闭群子午沙鼠的寄生虫感染及药物净化效果[J].中国实验动物学报,2016,24(5):499-502.

[9] 李学勇,李根平,贺争鸣,等.2006～2008年北京地区常用实验动物微生物和寄生虫检测结果分析[J].实验动物科学,2009,26(5):35-38.

[10] 王芊芊,丁贤明,陈瑜,等.胚胎移植技术用于微生物感染小鼠的生物净化[J].实验动物与比较医学,2013,33(1):69-71.

[11] 卢领群,宋晓明,戴方伟,等.长爪沙鼠的生物净化技术[J].中国比较医学杂志,2014,(4):62-66.

[12] 范涛,张坤,郑振水,等.Rag2敲除大鼠剖腹净化[J].实验动物科学,2014,31(4):18-20,23.

[13] 戴方伟,周莎桑,宋晓明,等.生物净化前后长爪沙鼠微生物和寄生虫携带情况的比较[J].实验动物与比较医学,2012,32(6):473-476.

[14] 朱莲,孔彭成,王美珊,等.剖宫产与体外授精技术在小鼠生物净化中的应用[J].实验动物与比较医学,2013,33(3):218-221.

[15] 詹纯列,李新春,肖育华,等.新西兰兔剖腹产人工净化[J].实验动物科学与管理,2001,18(3):44-46.