胸腺瘤合并重症肌无力患者Th17细胞检测及其临床意义*

张超逸 张鹏 吕扬 彭民 厉辛野 林翠玲

胸腺瘤是一种胸腺上皮来源的常见于前纵隔内的肿瘤，常伴发自身免疫性疾病。重症肌无力（myas⁃thenia gravis，MG）是一种依赖于T细胞、由抗体介导的神经肌肉接头处传递功能障碍的自身免疫性疾病，16%～28%合并胸腺瘤。免疫调节细胞参与MG发病过程［1］。辅助性T细胞17（Th17细胞）是CD4+T细胞亚群。Th17细胞及其细胞因子参与多种自身免疫性疾病的发病过程［2］，目前其在MG发病机制中的作用存在争议。然而在单纯胸腺瘤和胸腺瘤合并MG中，Th17细胞的变化与其分泌的IL-17、IL-21等因子的关系的文献报道相对较少。因此，本研究通过检测单纯胸腺瘤、胸腺瘤合并MG及健康患者外周血中CD4+T细胞中Th17细胞比例及血浆中IL-17、IL-21的变化，探讨其在单纯胸腺瘤及胸腺瘤合并MG发病机制中的作用，对于阐明胸腺瘤合并MG的发病机制并且指导临床治疗具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选取2015年10月至2017年10月经天津医科大学总医院心胸外科收治的胸腺瘤患者，共计78例，其中男性38例、女性40例，年龄范围38～65岁，平均年龄47岁。

1.2 方法

1.2.1 分组标准 上述研究对象，即试验组，根据患者有无MG分为胸腺瘤合并MG组（MG组）和单纯胸腺瘤组（Tm组），MG阳性诊断根据实验组患者的临床表现，新斯的明试验阳性或神经重复电刺激递减试验进行确诊；实验组患者在无手术禁忌证前提下接受胸腺瘤切除术，术后病理确诊为胸腺瘤，患者除MG以外不合并其他自身免疫性疾病，入院前从未服用皮质类固醇激素及免疫抑制剂。另外入组15例正常体检的患者作为对照组（Con组），并且近期无明显感染证据和自身免疫性疾病病史。各组间年龄、性别差异均无统计学意义，本研究通过天津医科大学总医院伦理委员会审批，所有受试者签署知情同意书。

1.2.2 分型 胸腺瘤病理类型根据Masaoka分型：A型12例，AB型18例，B1型16例，B2型15例，B3型17例，C型0例。术前MG患者Osserman分型：Ⅰ型3例，ⅡA型15例，ⅡB型14例，Ⅲ型3例，Ⅳ型0。

1.2.3 实验检测 试验组患者入院第2天、对照组查体当日各空腹抽取肘静脉血10 mL，其中5 mL肝素抗凝保存，4 h内待流式细胞术检测；5 mL血3 000 r/min离心10 min后取上层血清保存于-20℃冰箱。流式细胞仪检测外周血CD3+CD8+IL-17+Th17细胞占CD4+T细胞比例、CD4+T细胞占淋巴细胞比例、CD8+T细胞占淋巴细胞比例（流式细胞抗体购自美国eBioscience公司），ELISA法检测血清IL-17、IL-21、AchR-Ab水平（细胞因子ELISA试剂盒购自于英国Abcam公司）。

1.3 统计学分析

采用SPSS 19.0统计软件对数据进行统计学分析。数据以±s表示，组间比较用独立样本t检验，两因素相关性使用Pearson相关分析，患者临床资料选择二元Losgistic回归筛选临床危险因素预测指标。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 临床一般资料比较

本研究显示，3组患者从性别、年龄、体质量、CD8+T细胞/淋巴细胞差异无统计学意义，CD4+T细胞/淋巴细胞、血清AchR-Ab浓度在MG组表达最高（表1）。

2.2 不同组患者Th17/CD4+T细胞比例

术前不同组别流式细胞术（FCM）结果提示，MG组Th17细胞比例为10.33%±1.28%，Con组为7.33%±0.58%、Tm组为7.67%±2.18%，差异均具有统计学意义（图1）。

2.3 不同组患者Th17细胞分泌IL-17、IL-21水平变化及与AchR-Ab的相关性

通过比较可知，在MG组患者血浆中IL-17、IL-21、AchR-Ab水平最高，与Con和Tm组比较，差异均具有统计学意义（表2）。从Pearson相关性分析比较发现，MG组Th17的比例和分泌IL-17、IL-21水平呈正相关（IL-17：r=0.830，P＜0.001；IL-21：r=0.734，P＜0.001），Th17细胞比例和AchR-Ab浓度呈正相关（r=0.809，P＜0.001）。

Con组和Tm组的Th17比例和分泌IL-17水平无显著相关性，与IL-21呈正相关（IL-17-Con组：r=0.095，P=0.587；IL-17-Tm 组：r=0.198，P=0.255；IL-21-Con组：r=0.592，P=0.001；IL-21-Tm组：r=0.640，P＜0.001），同时 Con组、Tm组的Th17细胞比例和AchR-Ab浓度无显著相关性（Con组：r=0.098，P=0.577；Tm组：r=0.126，P=0.470），见图2～4。

表1 术前一般资料对比 （±s）

表1 术前一般资料对比 （±s）

参数性别（男/女）年龄（岁）体质量（Kg）CD4+T细胞/淋巴细胞（%）Con组（n=15例）7/8 42±15 45.34±7.32 52.32±6.78 Tm组（n=43例）18/25 39±17 48.45±5.22 60.28±9.21 MG组（n=35例）16/19 45±9 46.38±6.72 75.43±7.39*

表1 术前一般资料对比 （±s）（续表1）

表1 术前一般资料对比 （±s）（续表1）

*表示Tm组与MG组比较，P＜0.05，具有统计学意义

参数CD8+T细胞/淋巴细胞（%）血清AchR-Ab浓度（pmol/L）Con组（n=15例）38.59±6.21 15.23±3.32 Tm组（n=43例）43.23±9.89 16.87±4.89 MG组（n=35例）47.33±6.85 37.29±7.48*

2.4 不同临床及实验室指标与胸腺瘤合并MG预测的回归性分析

针对以下临床及实验室检查指标：性别、年龄、体质量、CD4+T淋巴细胞百分比、CD8+T淋巴细胞百分比、血清AchR-Ab浓度、Th17/CD4+T细胞百分比、血清IL-17及IL-21水平等指标进行二元Logistic回归分析，以是否合并MG为因变量。

结果显 示 ：其中血清 IL-17（OR=9.207，P＜0.001）、IL-21（OR=0.191，P＜0.001）水平、血清AchRAb（OR=76.497，P＜0.001）浓度是预测胸腺瘤合并MG的独立危险因素，值得注意的是，Th17/CD4+T细胞百分比（OR=-2.940，P=0.051）并不能成为预测胸腺瘤患者同时并发MG的独立危险因素。

图1 FCM检测Th17/CD4+T细胞

表2 不同患者IL-17、IL-21、血清AchR-Ab浓度对比 （±s）

表2 不同患者IL-17、IL-21、血清AchR-Ab浓度对比 （±s）

*表示Tm组与MG组比较，P＜0.05，具有统计学意义

参数IL-17（pg/mL）IL-21（pg/mL）血清AchR-Ab浓度（pmol/L）Con组（n=15例）7.45±3.46 84.33±5.13 15.23±3.32 Tm组（n=43例）8.22±1.67 93.00±7.21 16.87±4.89 MG组（n=35例）18.05±7.23*180.67±16.17*37.29±7.48*

图2 MG组Th17/CD4+T细胞与IL-17相关性

图3 MG组Th17/CD4+T细胞与IL-21相关性

图4 MG组Th17/CD4+T细胞与AchR-Ab相关性

3 讨论

MG是一种以胸腺为靶器官的自身免疫性疾病，有研究证实细胞免疫缺陷参与了MG的发病［3］。Th17细胞是近年来发现的功能性CD4+T细胞亚群，特异性表达IL-17。人类Th-17细胞是在TGF-β和IL-6共同诱导下由初始T细胞分化而来［4-5］。Th17细胞对维持机体免疫耐受起到重要的调节作用，可参与多种自身免疫性疾病发病［6］。有关Th17细胞及其相关细胞因子IL-17、IL-21参与早期胸腺瘤合并MG患者的发病过程及调控机制，目前仍有争议。

Th17细胞通过分泌相关细胞因子及促炎因子参与自身免疫性疾病的发病过程，IL-17主要由Th17细胞分泌，Th17细胞在宿主防御感染及自身免疫组织炎症中发挥重要作用［7-8］。应用抗IL-17抗体或抑制Th17细胞的分化，可以明显减轻疾病的症状。Th17及其细胞因子IL-17在桥本甲状腺炎患者外周血中增多［9］。另外，Th17在多发性硬化、乙型肝炎、风湿性心脏病、支气管哮喘等疾病发病中都起到了一定作用［8，10］。

本研究收集78例胸腺瘤患者，行各项临床及实验室检查后，无明显禁忌证，行胸腺瘤／胸腺切除术+脂肪清扫术。术前实验室检查发现，在胸腺瘤伴MG组患者中血清AchR-Ab浓度较正常对照和单纯胸腺瘤组升高，流式细胞术检测提示Th17细胞（CD3+CD8+IL-17+）占CD4+T细胞比例在MG组中最高，与Tm组和Con组相比差异具有统计学意义，另外在MG组中，Th17细胞比例与AchR-Ab的变化水平一致，呈正相关。ELISA检测提示IL-17、IL-21在MG组中最高，与Tm组和Con组相比差异具有统计学意义，与Th17的变化水平一致，呈正相关。在Tm组和Con组中，Th17细胞比例与IL-21呈正相关；但值得注意的是，Th17细胞比例与AchR-Ab、IL-17并无明显相关性。考虑其原因可能是IL-17为Th17细胞分泌的功能性因子，但其数量和功能并无一致性，Th17只有在分泌IL-17后才发挥其促炎效应，IL-21目前已公认是Th17自分泌［11］，可促进其自身细胞增殖，进而发现，IL-21水平越高，Th17百分比相应较高。但在未合并MG的胸腺瘤及正常对照患者中，Th17与IL-17二者并无相关，而在MG组中，二者呈正相关。说明Th17细胞通过分泌功能性因子IL-17促进MG的发生。

目前研究显示，Th17细胞与自身免疫性疾病的发生密切相关［12］。在实验性自身免疫性重症肌无力模 型（experimental autoimmune myasthenia gravis，EAMG）中，Th17细胞参与其自身免疫过程［13］。Th17细胞在B细胞和T细胞发生相互作用方面发挥重要作用［14］，导致自身致病性抗体的产生和实验性自身免疫性重症肌无力病情的进展。进一步研究表明，Th17细胞的数量与MG的严重程度和外周血AchRAb滴度呈正相关［15］。本实验与其研究结果基本一致。

综上，Th17细胞参与了胸腺瘤合并MG的疾病发生发展过程，Th17通过分泌IL-21促进自身细胞增殖，并通过分泌IL-17对MG进行调控。但其具体调控机制有待进一步研究。

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