侵袭性B细胞淋巴瘤中PIK3CA扩增和PTEN缺失及其临床病理学意义*

马明福 余丽 马志萍 张巍 崔文丽

侵袭性B细胞淋巴瘤是非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin's lymphoma，NHL）中常见的类型，其恶性程度较高，预后较差，容易复发；主要包括弥漫大B细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）、伯基特淋巴瘤（Burkitt lymphoma，BL）和一些形态介于DLBCL和BL之间不能分类的B细胞淋巴瘤。由于侵袭性B细胞淋巴瘤具有较大的生物学异质性及耐药特征等，其治疗依然面临巨大的挑战。

PI3K/Akt/mTOR信号通路在许多常见恶性肿瘤的疾病进展中发挥重要作用，包括侵袭性B细胞淋巴瘤。PI3K/Akt/mTOR信号传导通路的激活与侵袭性B细胞淋巴瘤患者预后呈负相关。侵袭性B细胞淋巴瘤中PIK3CA存在基因拷贝数变异（copy number variation，CNV），且CNV与预后的比较差异具有统计学意义（P＜0.05），提示PIK3CA的CNV在侵袭性B细胞淋巴瘤治疗中具有重要作用，但其作用及机制未知。PI3K/Akt/mTOR信号通路受磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）的正性调节，也受10号染色体上缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物（phosphate and tension homology deleted on chromsome ten，PTEN）的负性抑制。本研究通过荧光原位杂交技术检测侵袭性B细胞淋巴瘤中PIK3CA和PTEN基因表达情况及其与各临床病理指标间的相关性，旨在为侵袭性B细胞淋巴瘤的治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 病例资料

回顾性分析新疆医科大学第一附属医院2008年1月至2012年12月术前未经任何治疗的侵袭性B细胞淋巴瘤标本235例，其中DLBCL为205例，BL为27例，其他灰区淋巴瘤（介于DLBCL和BL之间，不能分类的B细胞淋巴瘤）3例。所选标本均具有完整的临床病理资料，并由2位高年资病理专家根据形态学和免疫表型重新阅片。发病年龄范围为23～78岁，平均发病年龄为53岁，中位发病年龄为54岁；＜60岁为147例，≥60岁为88例。其中男性139例，女性96例。通过电话随访患者，以确诊日期为起点，死亡日期为终点，随访的截止日期为2016年12月31日，共有42例失访，随访率为82.1%，失访患者自失访当月起按截尾数据计算。

1.2 方法

荧光原位杂交：选择美国Gene Technology公司提供的检测试剂盒，探针包括PIK3CA（货号：06N10-020）和PTEN（货号：04N62-020），应用LEICA原位杂交仪对所有病例进行PIK3CA和PTEN基因状态检测。结果判读：PIK3CA在胞核中2个绿色信号为阴性，＞2个绿色荧光信号为拷贝数扩增，随机计数100个肿瘤细胞，15%以上肿瘤细胞出现扩增视为阳性。PTEN在胞核中2个橙色2个绿色信号为阴性，＜2个橙色信号为拷贝数缺失，随机计数100个肿瘤细胞，15%以上肿瘤细胞出现缺失视为阳性。

1.3 统计学分析

采用SPSS 17.0软件对数据进行统计学分析。计数资料的组间比较采用χ2检验和Fisher确切概率法，生存资料单因素分析采用Kaplan-Meier法，相关性分析采用Spearman法。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 基本临床病理特征

本研究共纳入侵袭性B细胞淋巴瘤患者235例，其中男性139例，女性96例；病变直径≤10 cm为199例，＞10 cm为36例；原发部位在淋巴结内为158例，在淋巴结外为77例；国际预后指数（IPI）0～1分为124例，2分为54例，3分为35例，4～5分为22例；体能状态（PS）评分≤2分为197例，＞2分为38例；出现B症状（体质量减轻＞10%、发热、夜间盗汗）为121例，未出现B症状为114例；临床病理分期Ⅰ、Ⅱ期为139例，Ⅲ、Ⅳ期为96例；累及淋巴结个数（exln2）≤2个为189例，＞2个为46例；乳酸脱氢酶（LDH）水平≤240IU/L为129例，＞240IU/L为106例（表1）。侵袭性B细胞淋巴瘤H&E染色显示体积中等到较大的淋巴细胞，核呈圆形或卵圆形，染色质细腻，可见1个大核仁，核分裂像易见（图1A），免疫组织化学CD20肿瘤细胞显示弥漫膜强阳性（图1B）。

2.2 侵袭性B细胞淋巴瘤中PIK3CA的相关研究

2.2.1 侵袭性B细胞淋巴瘤中PIK3CA的扩增情况 侵袭性B细胞淋巴瘤中PIK3CA正常表达，显示2个绿色信号（图2A）；侵袭性B细胞淋巴瘤中PIK3CA扩增，显示＞2个绿色信号（图2B）。

2.2.2 PIK3CA扩增与侵袭性B细胞淋巴瘤各临床病理特征的关系 按照纳入、排除标准收集的235例侵袭性B细胞淋巴瘤标本中，PIK3CA基因的扩增率为12.3%（29/235），临床分期Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期的阳性率分别为8.6%（12/139）和17.7%（17/96），差异具有统计学意义（P=0.038）。PIK3CA与年龄、性别、肿瘤直径、原发部位、IPI、PS评分、B症状、exln2和LDH水平等组间比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），PIK3CA扩增与PTEN缺失之间的比较差异具有统计学意义（P=0.046，表1）。

2.2.3 PIK3CA扩增与侵袭性B细胞淋巴瘤患者生存期的关系 PIK3CA扩增与生存期无显著相关性（P=0.135，图3）。

2.3 侵袭性B细胞淋巴瘤中PTEN的相关研究

2.3.1 侵袭性B细胞淋巴瘤中PTEN的缺失情况 侵袭性B细胞淋巴瘤中PTEN正常表达，显示2个红色、2个绿色信号（图4A）；侵袭性B细胞淋巴瘤中PTEN缺失，显示绿色信号2个，而红色信号仅1个或无红色信号（图4B）。

2.3.2 PTEN缺失与侵袭性B细胞淋巴瘤各临床病理特征的关系 PTEN基因在235例侵袭性B细胞淋巴瘤中总阳性率为13.6%（32/235），临床分期Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期的阳性率分别为12.9%（18/139）和14.6%（14/96），两者间的差异无统计学意义（P=0.720）。PTEN与其他临床病理指标，如年龄、性别、肿瘤直径、原发部位、IPI、PS评分、B症状、exln2和LDH水平等组间比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），PTEN缺失与PIK3CA扩增之间的比较差异具有统计学意义（P=0.046，表2）。

2.4 PTEN缺失与侵袭性B细胞淋巴瘤患者生存期的关系

PTEN缺失与生存期无显著相关性（P=0.932，图5）。

表1 PIK3CA与患者临床病理特征的关系

图1 侵袭性B细胞淋巴瘤

图2 侵袭性B细胞淋巴瘤中PIK3CA表达情况

图3 PIK3CA扩增与生存期无显著相关性

图4 侵袭性B细胞淋巴瘤中PTEN的缺失情况

表2 PTEN与患者临床病理特征的关系

▶图5 PTEN缺失与生存期无显著相关性

3 讨论

侵袭性B细胞淋巴瘤为最常见的一类NHL，其恶性程度较高，虽然对常规放化疗较为敏感，但易复发或耐药，主要包括DLBCL、BL和一些灰区淋巴瘤［1］。

DLBCL是一组常见的侵袭性B细胞淋巴瘤，占所有恶性淋巴瘤的30%～40%［2］。BL最常见于儿童和青少年，分为地方型、散发型和免疫缺陷相关型。地方型与EBV感染相关。灰区淋巴瘤为形态介于DLBCL和BL之间不能分类的B细胞淋巴瘤，同时具有上述两种淋巴瘤的形态，但是又不能归为其中的任何一类［3］。

PI3K/Akt/mTOR信号通路在恶性细胞发生发展中发挥重要作用，包括细胞生长、存活和增殖［4］。目前，已经发现该通路在多种恶性肿瘤中特异表达，包括侵袭性B细胞淋巴瘤［5］。PI3K/Akt/mTOR信号通路受PI3K基因的正向调节和PTEN基因的负性抑制。PI3K为一种胞内磷脂酰脂质激酶，称作磷脂酰肌醇3激酶，根据其结构特点和底物特异性可以分为3类（Ⅰ～Ⅲ类）［6］。Ⅰ类PI3K研究最为广泛，包括催化亚基PIK3CA、PIK3CB、PIK3CD、PIK3CG和调节亚基PIK3R1、PIK3R2、PIK3R3。其中催化亚基在肿瘤的发生发展中起主要作用［7］。

PIK3CA基因在许多恶性肿瘤中扩增，包括肺癌［8］、子宫颈癌［9］、大肠癌［10］，头颈部癌［11］、乳腺癌［12］及淋巴瘤［13］等。Xu等［14］对73例确诊的DLBCL患者进行随访，其中男性45例和女性28例，年龄为18～78岁，中位年龄为50岁，检测指标包括：患者年龄、性别、PS评分、LDH水平、肿瘤分期、免疫表型、淋巴结外侵犯的数量、5年生存率、磷酸化的蛋白激酶（phosphorylated protein kinase B，p-AKT）表达等进行统计学分析，结果显示p-AKT阳性患者预后较差，提示PI3K/Akt/mTOR信号通路与DLBCL患者预后呈负相关。在侵袭性B细胞淋巴瘤中，PI3K的CNV与肿瘤的发生有关，Cui等［15］研究发现，在DLBCL 中存在PI3K的CNV。PIK3CA的CNV与p110α异常表达和PI3K/Akt/mTOR信号通路激活相关。PIK3CA的CNV对于DLBCL患者的预后具有重要意义。PIK3CA扩增导致Akt的磷酸化，PI3K/Akt/mTOR信号通路被激活，提示PIK3CA扩增可能具有致癌性［16-17］。在本研究中，患者PIK3CA基因总扩增率为12.3%（29/235），临床分期Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期的扩增率分别为8.6%（12/139）和17.7%（17/96），后者显著高于前者，差异具有统计学意义（P=0.038），提示PIK3CA扩增与疾病晚期相关。而PIK3CA与年龄、性别、肿瘤直径、原发部位、IPI、PS评分、B症状、exln2和LDH水平等组间比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），因为样本量较小，亟需扩大样本量进行检验。PIK3CA扩增与PTEN缺失之间的比较差异具有统计学意义（P=0.046）。Ma等［18］研究显示，48例DLBCL中12例存在p-AKT活化，其中15例PTEN的表达缺失，P-AKT和PTEN表达呈显著负相关（r=-0.450，P＜0.05），提示PI3K/Akt/mTOR信号通路的调节参与DLBCL的进展，并且可能参与部分DLBCL患者对利妥昔单抗的耐药。

PTEN为PI3K/Akt/mTOR信号通路的负调控因子，其在控制细胞生长、存活和增殖中发挥重要作用，具有磷酸酶活性。3、4、5三磷酸磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol trisphosphate，PIP3）为PI3K的产物，PTEN可以将PIP3脱磷酸成3、4二磷酸磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol diphosphate，PIP2），从而抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路的下游，包括Akt和mTOR，最终抑制该信号通路的激活［19］。Pfeifer等［20］研究发现PTEN抑癌基因通常差异性表达，在大部分GCB型DLBCL患者中发现PTEN缺失，然而在ABC型DLBCL患者中却较少缺失，在11个GCB-DLBCL细胞系中7个PTEN缺失，几乎全部ABCDLBCL细胞系均有PTEN表达，提示GCB-DLBCL可能与PTEN缺失有关［21］，而在本研究中120例GCB-DLBCL样本仅25例缺失，115例ABC-DLBCL样本仅18例缺失，与Pfeifer等［20］的试验结果不同，可能因本研究样本量较大，更能接近真实情况。Lenz等［22］在原发DLBCL中开展了基因表达谱分析，发现PTEN缺失为GCB-DLBCL所特有。在本研究中，PTEN与IPI之间虽然差异无统计学意义（P=0.081），但是4～5组PTEN缺失率为27.6%明显优于0～1组PTEN缺失率为11.3%。PTEN与年龄、性别、肿瘤直径、原发部位、IPI、PS评分、B症状、临床分期、exln2和LDH水平等组间比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。以上与Jensen等［23］研究结果相同，提示PTEN或为非侵袭性B细胞淋巴瘤中PI3K/AKT/mTOR活化的主要因素。

综上所述，PIK3CA扩增在临床分期Ⅲ～Ⅳ期DLBCL中的阳性率较高，说明PIK3CA扩增与临床分期相关，PIK3CA扩增可能促进了DLBCL的发生发展。而PTEN也已被确定为肿瘤抑制基因，虽然本研究未发现PTEN与DLBCL各临床病理指标有显著相关性，但不能断定其与DLBCL发生发展无关。目前，已知PI3K/Akt/mTOR信号通路的活化促进了DLBCL的发展，而本研究证明PIK3CA扩增与临床分期相关，有可能通过抑制PIK3CA扩增治疗相关DLBCL患者，为临床选择新的靶向药物提供了理论依据。

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