MG53蛋白对脂多糖诱导的小鼠海马神经元细胞氧化损伤的影响

李 鹏，马珊珊，黄团结，刘雯雯，许 玲，刘艳霞，刘腾飞，周建康，杨 波，关方霞

1)郑州大学生命科学学院 郑州 450001 2)河南大学附属郑州颐和医院病理科 郑州 450047 3)郑州大学第一附属医院神经外科 郑州 450052

HT22是一种永生化的小鼠海马神经元细胞,具有典型的神经元形态及特征,被广泛应用于研究神经元的损伤以及神经退行性疾病[1]。在创伤性脑损伤、烧伤等疾病中，患者往往会并发内毒素血症，创面和体内存在大量内毒素，影响神经细胞的存活和增殖。脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)是革兰阴性菌细胞壁的主要成分，是一种内毒素，能够诱导免疫细胞产生多种促炎因子和趋化因子，引起细胞凋亡，导致多种器官的损伤[2]。MG53蛋白是TRIM家族蛋白成员之一[3]，主要定位于细胞质，当细胞膜发生损伤后可快速定位到损伤部位，进行细胞膜的修复。本课题组前期研究[4]结果显示，MG53蛋白对人脐带间充质干细胞的氧化损伤具有一定的保护作用。因此，本实验拟用LPS诱导HT22细胞建立神经元氧化损伤模型，进而观察MG53蛋白对HT22细胞是否有保护作用。

1 材料与方法

1.1实验材料小鼠海马神经元细胞系HT22购自北京欧林格生物科技有限公司，MG53蛋白由美国俄亥俄州立大学麻建杰教授赠送，LPS购自美国Sigma-Aldrich公司，DMEM高糖培养基、磷酸盐缓冲液、胰蛋白酶、细胞培养用青霉素链霉素混合液购自美国Hyclone公司，胎牛血清购自美国Gemini公司，CCK-8细胞增殖-毒性检测试剂盒购自日本同仁化学研究所，细胞周期检测试剂盒、细胞凋亡检测试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司，超氧化物歧化酶(SOD)测试盒和丙二醛(MDA)测试盒购自南京建成生物公司，β-actin、Bcl-2、Bax和Cyclin D1多克隆抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司。

1.2细胞培养HT22细胞培养于DMEM高糖培养基(含体积分数10%胎牛血清，100 U/mL青霉素和0.1 g/L链霉素)中，放置于37 ℃、体积分数5% CO2饱和湿度培养箱中培养。待细胞铺满25T培养瓶底80%左右时，用2.5 g/L胰蛋白酶消化液处理1 min左右，按13传代，隔天换液，取培养3代以后的细胞用于后续实验。

1.3LPS对HT22细胞作用浓度和时间的筛选取对数生长期的HT22细胞接种于96孔板，每孔加入100 μL(密度为5×104mL-1)细胞悬液，37 ℃、体积分数5% CO2饱和湿度条件下培养16～18 h，细胞贴壁后弃上清,加入用完全培养基配制的LPS(LPS终浓度分别为25、50、100、250、500、1 000、1 500 mg/L)，在37 ℃、体积分数5% CO2饱和湿度条件下继续培养12、24、36、48、60 h。每孔加入CCK-8试剂10 μL，37 ℃继续孵育2 h，酶标仪测定450 nm波长处的吸光度，计算细胞增殖抑制率。每个浓度组设置3个复孔。细胞存活率=(实验组吸光度-空白吸光度)/(对照吸光度-空白吸光度)×100%。细胞增殖抑制率=1-细胞存活率。

1.4实验分组取对数生长期的HT22细胞, 分4组培养。NC组正常培养，模型组培养液中加入500 mg/L LPS，MG53组培养液中加入30 mg/L MG53，MG53+模型组培养液中同时添加30 mg/L MG53和500 mg/L LPS。

1.5观测指标

1.5.1 细胞存活率 取对数生长期的HT22细胞接种于96孔板，按1.4分组处理48 h后， CCK-8法检测细胞存活率。每组设置3个复孔。

1.5.2 细胞凋亡率 取对数生长期的HT22细胞接种于6孔板培养,待细胞融合度达到60%以上时，按1.4分组处理48 h，用不含EDTA的胰蛋白酶消化细胞，离心收集后用PBS洗2遍，取5×105个细胞，加入500 μL的Binding Buffer悬浮，然后加入5 μL Annexin V-FITC混匀，再加入5 μL Propidium Iodide混匀,室温、避光反应 5～15 min， 1 h以内上流式细胞仪检测细胞凋亡率。每组设置3个复孔。

1.5.3 细胞周期 取对数生长期的HT22细胞接种于6孔板，按1.4分组处理48 h。离心收集细胞，调整细胞密度为1×106mL-1，取1 mL细胞悬液，PBS洗2遍，离心去上清，在沉淀中加入体积分数为70%预冷乙醇500 μL固定，4 ℃过夜。用PBS洗去固定液，加100 μL RNase A，37 ℃水浴30 min，再加入400 μL PI染色混匀，4 ℃避光30 min，最后上流式细胞仪检测，激发波长488 nm。每组设置3个复孔。

1.5.4 细胞迁移距离 铺板前在6孔板底部均匀划横线，每孔5条，然后板中培养细胞，待细胞融合度达到60%以上时，用枪头垂直底部划横线，PBS清洗3遍，在显微镜下拍照记录原始划痕，然后按1.4分组处理48 h后，在显微镜下再次拍照记录，用Image J软件分析迁移距离(单位为μm)。每组设置3个复孔。

1.5.5 细胞内SOD活性 将HT22细胞接种于96孔板，按1.4分组处理48 h。离心收集细胞并计数，调整细胞密度1×106mL-1，超声破碎，用微量分光光度计测量蛋白浓度，按SOD测试盒说明书操作，检测细胞内SOD活性。每组设置3个复孔。

1.5.6 细胞内MDA含量 将HT22细胞接种于96孔板，按1.4分组处理48 h。按MDA测试盒说明书操作，检测细胞内MDA含量。每组设置3个复孔。

1.5.7 Bcl-2、Bax和CyclinD1蛋白的表达 取对数生长期的HT22细胞接种于6孔板培养，按1.4分组处理48 h。收集细胞，提取蛋白，采用BCA试剂盒测定蛋白浓度。SDS-PAGE进行蛋白质的分离，转至PVDF膜，50 g/L脱脂奶粉液封闭2 h，加一抗(β-actin按12 000、Bcl-2 按11 000、Bax按1500、Cyclin D1按12 000稀释) 4 ℃孵育过夜，TBST洗膜 3 次，加二抗(山羊抗兔HRP，12 000稀释) 室温孵育2 h，TBST洗膜3次，随后ECL化学发光显影成像，利用Image J软件进行灰度分析。每组设置3个复孔。

1.6统计学处理采用SPSS 19.0分析数据。不同浓度LPS作用不同时间后HT22细胞增殖抑制率的比较采用5×7析因设计的方差分析；4组细胞存活率、凋亡率、细胞周期、迁移距离、细胞内SOD活性和MDA含量，以及Bcl-2、Bax和Cyclin D1蛋白表达的比较采用2×2析因设计的方差分析；检验水准α=0.05。

2 结果

2.1LPS作用浓度和时间的确定不同质量浓度LPS作用不同时间后HT22细胞增殖抑制率的比较见表1。由表1可知，低浓度(25、50、100、250 mg/L)LPS促进细胞增殖，高浓度LPS抑制细胞增殖。其中500 mg/L LPS作用于HT22细胞48 h，细胞增殖抑制率接近50%，因此选择该作用条件用于后续实验。

表1 不同质量浓度LPS作用不同时间后HT22细胞增殖抑制率的比较(n=3) %

F浓度=1 878.000，F时间=206.800，F交互=30.760，P均<0.001。

2.2MG53对LPS诱导的HT22细胞存活、凋亡和迁移能力的影响4组细胞存活率、凋亡率和迁移距离的比较见图1、表2。该结果说明LPS可降低HT22细胞存活率，提高其凋亡率，降低其迁移能力；MG53预处理可以在一定程度上拮抗LPS对HT22细胞的增殖抑制作用，提高HT22细胞的迁移能力。

2.3MG53对LPS诱导的HT22细胞周期的影响

结果见表3。这一结果说明LPS可阻止HT22细胞由G0/G1期向S期运转；而MG53有助于促进HT22细胞周期从G0/G1期向S期运转。

2.4MG53对LPS诱导的HT22细胞内SOD活性和MDA含量的影响结果见表4。这一结果说明LPS可诱导HT22细胞发生氧化损伤，而MG53能够提高HT22细胞的抗氧化能力。

2.5MG53对LPS诱导的HT22细胞内Bcl-2、Bax和CyclinD1蛋白表达的影响结果见图2、表5。该结果说明LPS可诱导HT22细胞内凋亡相关蛋白Bax的表达增加，Bcl-2蛋白表达降低，同时降低周期相关蛋白Cyclin D1的表达；而MG53可促进HT22细胞内Cyclin D1的表达，抑制Bcl-2的表达。

图1 划痕实验

表2 4组细胞存活率、凋亡率和迁移距离的比较

表3 4组细胞周期的比较 %

表4 4组细胞内SOD活性和MDA含量的比较

图2 Bax、Bcl-2和Cyclin D1蛋白的表达

表5 4组Bcl-2、Bax和Cyclin D1蛋白表达的比较

3 讨论

目前，以LPS为应激源诱导的氧化损伤模型有很多，如LPS诱导的大鼠肝损伤[5]、LPS诱导的奶牛子宫内膜上皮细胞氧化损伤[6]和LPS诱导的小鼠急性脑损伤[7]模型等，但关于建立LPS诱导HT22细胞氧化损伤模型的研究较少。氧化损伤细胞模型建立的关键在于细胞存活率的控制。本实验发现HT22细胞具有较强的内毒素耐受性，LPS作用浓度大于250 mg/L才会对其产生明显的毒素作用；500 mg/L的LPS作用HT22细胞48 h，细胞增殖抑制率接近50%，因此本实验选用500 mg/L LPS处理48 h建立HT22氧化损伤模型。

研究[8-9]发现MG53在细胞膜损伤和组织损伤修复中发挥关键性作用，对肺、肾脏、脑等组织损伤具有保护和修复作用[10-11]。同时MG53对肌细胞、上皮细胞、神经细胞、间质细胞以及干细胞等也具有损伤保护作用[12]。本研究发现，MG53能够增强HT22细胞的增殖和迁移能力，抑制细胞凋亡，促进细胞由G0/G1期向S期运转，提高周期蛋白Cyclin D1表达，增强HT22细胞的抗氧化能力。LPS诱导HT22细胞损伤后，细胞内Bax表达量增加，Bcl-2表达量下降；而MG53蛋白干预可减少HT22的凋亡，增加Bcl-2的表达并降低Bax的表达。

综上所述，MG53能够减轻LPS诱导的HT22氧化损伤，这为MG53蛋白应用于神经性损伤的保护和修复提供了理论依据。

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[6] 吕安,张志聪,宫平,等.LPS诱导奶牛子宫内膜上皮细胞氧化损伤模型的建立[J].北京农学院学报,2016,31(4):61

[7] 刘玲,邱相君,和素娜,等.芍药苷对LPS脑损伤模型小鼠氧化应激和能量代谢的影响[J].中国中药杂志,2015,40(14):2871

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