豆腐柴叶蛋白闪式提取工艺优化计及其体外抗氧化活性研究

陶阿丽，冯学花，曹殿洁，华芳，杨梅兰

(安徽新华学院药学院，安徽 合肥 230088)

豆腐柴(PremnamicrophyllaTurcz )学名观音草，属马鞭草科灌木植物[1]，广泛分布于我国华东、华南等地。豆腐柴的根、茎、叶均可入药，具有清热解毒、消肿止血等功效[2]。据报道，豆腐柴叶中富含多种天然活性成分，其中蛋白质含量高达21%～34%。实验表明，豆腐柴叶中蛋白质安全、无毒，具有提高机体免疫力、降低胆固醇和抗疲劳等营养功效[2,3]，可作为功能食品开发的重要原料。

植物蛋白提取方法很多，闪式提取法是近年来新兴的一种提取方法，将植物快速破碎实现有效成分的迅速渗透、释放，方法简单、快速、环保[4,5]。目前，对于采用闪式提取法提取豆腐柴叶蛋白的研究报道较少[6,7]。本研究以豆腐柴叶为原料，利用响应面法优化豆腐柴叶蛋白闪式提取工艺条件，进行豆腐柴叶蛋白体外抗氧化活性研究，以期为豆腐柴叶功能性产品的开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

豆腐柴叶：采摘于安徽新华学院药学院植物组培实验室，鲜叶洗净后自然风干，粉碎过50目筛，贮存备用；考马斯亮蓝G-250、标准牛血清白蛋白、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、三羟基氨基甲烷(Tris)购自上海海拓试剂有限公司；其他试剂(AR级)购自国药集团化学试剂有限公司。

LN12-JHBE50T闪式提取器(北京中西远大科技有限公司)；FY130型中药粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)；TDL-40B高速离心机(上海安亭科学仪器厂)；DZF-6020型恒温鼓风干燥箱(上海三发科学仪器有限公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 豆腐柴叶蛋白的闪式提取

精确称取50.0g豆腐柴叶粉末，按照一定液料比加入蒸馏水充分混匀，用1.0mol/L NaOH溶液调节至一定pH，设定温度为50℃，在一定电压下闪式提取一定时间后，以6000r/min离心10min。收集上层清液，用1.0mol/L HCl调节pH至等电点，使豆腐柴叶蛋白沉淀，以6000r/min离心5min，弃去上层清液后真空冷冻干燥，即得豆腐柴叶蛋白。豆腐柴叶蛋白提取率按如下公式进行计算：

豆腐柴叶蛋白提取率=(提取液中蛋白质含量/豆腐柴叶蛋白质含量)×100%

1.2.2 牛血清白蛋白标准曲线的绘制

称取100mg考马斯亮蓝G-250溶于50mL 95%乙醇中，加入100mL 85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000mL。取6只试管，分别加入0.1mg/mL的牛血清白蛋白标准溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，加蒸馏水定容至1mL，在每只试管中加入5mL考马斯亮蓝溶液，充分震荡，静置2min后在595nm处测光密度。以蛋白含量为横坐标，以光密度为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为：Y=2.2729X+0.0045，R2=0.995，说明牛血清白蛋白在0～0.1mg/mL范围内呈良好的线性关系。

1.2.3 单因素试验

1)闪提时间 取适量豆腐柴叶粉末，在pH为11.0、液料比(mL∶g)为40∶1、闪提电压为120V条件下分别提取120、150、180、210、240s，考察闪提时间对豆腐柴叶蛋白提取率的影响。

2)液料比 取适量豆腐柴叶粉末，分别在液料比(mL∶g)10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1以及pH为11.0、闪提电压为120V条件下提取180s，考察液料比对豆腐柴叶蛋白提取率的影响。

3)闪提电压 取适量豆腐柴叶粉末，固定pH为11.0，液料比(mL∶g)为40∶1，分别在闪提电压为80、100、120、140、160V条件下提取180s，考察闪提电压对豆腐柴叶蛋白提取率的影响。

4)pH 取适量豆腐柴叶粉末，分别在pH为8.0、9.0、10.0、11.0、12.0以及固定液料比(mL∶g)为40∶1、电压为120V条件下闪式提取180s，考察不同pH对豆腐柴叶蛋白提取率的影响。

1.2.4 响应面试验

在单因素试验结果的基础上，根据Box-Behnken中心组合设计原理，以豆腐柴叶蛋白提取率为响应值，选择闪提时间(A)、液料比(B)、闪提电压(C)和pH(D)为自变量，采用Design-expert软件设计响应面试验，其因素及水平详见表1。

表1 响应面试验因素及水平

1.2.5 豆腐柴叶蛋白体外抗氧化实验

将在响应面法优化的最佳工艺条件下提取得到的豆腐柴叶蛋白配制成一定浓度的样品进行体外抗氧化实验研究。

1)DPPH自由基清除能力的测定 取不同质量浓度的样品溶液2mL于试管中，加入0.04mg/mL的DPPH乙醇溶液3mL，混合均匀后置暗处静置30min，在517nm处测定光密度D1。以蒸馏水2mL加入0.04mg/mL的DPPH乙醇溶液3mL混合，测定空白对照光密度D0。将2mL样品与3mL无水乙醇混合，测定样品本身光密度D2[8，9]。以Vc为阳性对照组，各组实验平行3次取平均值，豆腐柴叶蛋白对DPPH自由基的清除率按下式计算。

2)超氧阴离子自由基清除能力的测定 取不同质量浓度的样品溶液1mL于试管中，加入0.1 mol/mL Tris-HCl(pH8.2)缓冲溶液5mL，于25℃水浴20 min，加入已经于25 ℃预热的7mmol/L邻苯三酚溶液0.3mL，25 ℃恒温反应5min，加入10mol/L盐酸2mL，在420nm处测定光密度D1,以1mL蒸馏水代替样品溶液，测定光密度D0。以Vc为阳性对照组，各组实验平行3次取平均值，豆腐柴叶蛋白对超氧阴离子自由基的清除率按下式计算。

2 结果与分析

2.1 闪提时间对豆腐柴叶蛋白提取率的影响

图1 不同闪提时间下的豆腐柴叶蛋白提取率

由图1可知，豆腐柴叶蛋白提取率随着闪提时间的增长而增加，在闪提180s时达到最大提取率。180s后，延长闪提时间，豆腐柴叶蛋白提取率并未有明显改变。可能因为随着提取时间的延长，闪式提取器的刀头通过不断机械剪切原料，增加了原料与溶剂的接触面，从而有利于蛋白的溶出。随着溶剂中蛋白的饱和，提取时间达一定程度后，豆腐柴叶蛋白提取率未见明显增高。因此，选择合适的闪提时间为180s。

2.2 液料比对豆腐柴叶蛋白提取率的影响

图2 不同液料比下的豆腐柴叶蛋白提取率

图3 不同闪提电压下的豆腐柴叶蛋白提取率

由图2可知，随着液料比的增加，豆腐柴叶蛋白提取率明显增加，当液料比(mL∶g)大于40∶1后，豆腐柴叶蛋白提取率稍有降低。前期随着溶剂用量的增加，有利于蛋白的扩散及溶出，当蛋白提取率达到最大值后，溶剂用量继续增加会增加热能消耗、溶剂回收损耗等，造成提取率有所下降。因此，选择合适的液料比(mL∶g)为40∶1。

2.3 闪提电压对豆腐柴叶蛋白提取率的影响

由图3可知，豆腐柴叶蛋白提取率随着闪提电压的增大而增加，在120V时达到最大提取率，120V后提取率有所下降。原因可能是电压的增高使闪式提取器的转速加大，但是高速运转的摩擦加快提取溶剂的挥发，反而降低提取率。因此，选择最佳的闪提电压为120V。

2.4 pH对豆腐柴叶蛋白提取率的影响

由图4可知，在pH在8.0～11.0之间，豆腐柴叶蛋白的提取率呈现增加状态，这是因为豆腐柴叶中的蛋白大部分为酸性蛋白质，增加碱性有利于豆腐柴叶蛋白的溶出，提取率明显增加。当pH继续增加后，由于发生Maillard反应[10]，造成部分蛋白质变质而引起提取率降低。因此，选择合适的pH为11.0。

2.5 响应面试验结果

响应面试验结果见表2，响应面试验数据的ANOVA分析结果见表3。

图4 不同pH下的豆腐柴叶蛋白提取率

表2 响应面试验设计及结果

表3 ANOVA分析结果

求解多元二次回归方程获得模型最大值，即闪提时间为163.59s、液料比(mL∶g)为41.54∶1、闪提电压为119.85V、pH为11.25，豆腐柴叶蛋白提取率达到最大值，为63.0268%。考虑实际操作性，修正响应面模型回归所得的最佳提取工艺，确定最佳提取工艺为：闪提时间为164s、液料比(mL∶g)为42∶1、闪提电压为120V、pH为11.3。

为验证响应面曲线法所得结果的可靠性，根据上述修正后优化条件提取豆腐柴叶蛋白，重复进行3次平行试验，得豆腐柴叶蛋白平均提取率为63.06%(RSD为0.939%)，与模型所得理论预测值63.0268%非常接近，说明该模型可靠有效。

2.6 豆腐柴叶蛋白对DPPH自由基清除能力

具有抗氧化能力的物质会降低DPPH自由基在517nm处的吸收，因此可以DPPH·清除率来评价物质的抗氧化作用[11]。不同浓度豆腐柴叶蛋白对DPPH自由基的清除率如图6所示。结果表明，在0.2～1.0mg/mL范围内，随着豆腐柴叶蛋白浓度的增加，其对DPPH自由基的清除能力增强。豆腐柴叶蛋白对DPPH自由基的清除能力显著低于相同浓度的阳性对照组Vc(P<0.05)。

2.7 豆腐柴叶蛋白对超氧阴离子自由基清除能力

3 结论

图5 豆腐柴叶蛋白提取率的响应面图

以豆腐柴叶为原料，采用简单高效的闪式提取法提取豆腐柴叶蛋白，通过响应面模型优化获得豆腐柴叶蛋白最佳提取工艺为：闪提时间为164s、液料比(mL∶g)为42∶1、闪提电压为120V、pH为11.3，豆腐柴叶蛋白的平均提取率为63.06%，与模型预测值拟合度较高。采用DPPH自由基、超氧阴离子自由基2种体外抗氧化模型，考察豆腐柴叶蛋白的体外抗氧化能力，结果显示，豆腐柴叶蛋白对DPPH自由基、超氧阴离子自由基均具较明显的清除作用，清除率与豆腐柴叶蛋白浓度存在着明显的量效关系，但清除能力均弱于阳性对照组Vc。

图6 不同浓度豆腐柴叶蛋白对DPPH·的清除率图7 不同浓度豆腐柴叶蛋白对O-2·的清除率

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