RNA干扰沉默SOX9对肾细胞癌786⁃O细胞体外增殖、凋亡及裸鼠成瘤能力的影响

楚广民 张建波 孙淼淼

肾细胞癌是泌尿系统中仅次于膀胱肿瘤的最常见的恶性肿瘤之一，约占肾脏恶性肿瘤的85%［1］。肾癌对于传统药物和放射治疗不敏感，预后相对较差，所以寻找新的治疗方法显得尤为重要。SOX9（sex determining region Y⁃box 9）属于SRY（sex determination region of Y chromosome）相关基因家族，目前为止共发现20多个SOX基因家族，其共同特点是各个基因都含有一个保守的HMG⁃box DNA 结合域［2］。有研究表明，SOX9基因的表达异常与结直肠癌、肺癌及胰腺癌等多种肿瘤进展相关［3⁃5］。目前干扰SOX9基因表达对肾癌细胞增殖、凋亡及裸鼠成瘤的影响仍有待进一步研究。本研究采用小干扰RNA（small interfer⁃ing RNA，siRNA）技术沉默下调肾细胞癌786⁃O细胞中SOX9基因的表达，检测其对786⁃O细胞增殖、凋亡及裸鼠成瘤的影响，为肾细胞癌的临床治疗提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料

肾细胞癌786⁃O细胞株购自ATCC（American Type Culture Collection）。细胞培养基为RPIM⁃1640（美国Hyclone公司），其中添加10%胎牛血清、青霉素100 IU/mL及链霉素100 IU/mL。所用实验动物均为BALB/c雌性裸鼠，4～6周龄，购于北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.2 主要仪器和试剂

Multiskan FC酶标仪购自美国Thermo公司，cx41荧光显微镜购自日本Olympus公司。Hoechst 33342细胞凋亡试剂盒购于北京联科生物科技有限公司，CCK⁃8试剂盒购于日本东仁化工公司，免疫组织化学抗体Ki⁃67购自美国Santa cruz公司。

1.3 实验与方法

1.3.1 siRNA细胞转染及qPCR

SOX9siRNA 有效序列为：上游：5′⁃AG⁃CAAGTCCGCGAGCCAGTAC⁃3′，下游：5′⁃GGT⁃GTGCCTTCTGTGCTGCAC⁃3′；对照组序列为：上游：5′⁃UCCACUGTCACUGGUCCGATT⁃3′，下游：5′⁃CGUGACAGUGCCGAGAAT⁃3′。具体转染方法如下：细胞生长融合度为70%～80%时，按操作说明书，分别将INTERFERINGTM转染试剂（Poly⁃plus Transfection公司，法国）和SOX9 siRNA或阴性对照序列（50 nmol/L的终浓度）加入786⁃O细胞培养液中，将细胞继续置于细胞孵化箱中转染。48 h后，收集细胞用于后续功能检测。取转染后的细胞，用Trizol法提取总RNA。按cDNA反转录酶试剂盒（北京达科为生物技术有限公司）说明书进行操作，将2 μg Total RNA反转录为cDNA，以此为模板进行扩增。SOX9序列：上游：5′⁃CAGAAGTACTGGGAAAGTCGT⁃3′，下游：5′⁃CC⁃GGTACTTGTAGTTGGGGTAGT⁃3′。内参GAP⁃DH序列：上游：5′⁃AGCCTCAAGATCATCAG⁃CAAT⁃3′，下游：5′⁃TGTGGTCATGAGTCCTTC⁃CACG⁃3′。反应体系总体积 20 μL，其中模板 cD⁃NA为1.5 μL，上、下游引物分别为1 μL，SYBR混合物 10 μL，无菌蒸馏水 6.5 μL。反应条件：95℃预变性3 min，95℃变性10 s，60℃退火30 s，70℃延伸30 s，共30个循环。以GAPDH作为内参，用2⁃△△Ct法进行数据分析。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.3.2 CCK⁃8法检测细胞活性

将各组786⁃O细胞制成细胞混悬液，以3×104个/孔的密度种于96孔板中，于细胞孵箱中分别孵育0、24、48、72 h。用100 μL的无血清细胞培养基与10 μL的CCK⁃8试剂混匀并加入各孔之中，于37℃细胞培养箱继续孵育1 h。最后将96孔板置于酶标仪下，于450 nm激发光下测定光密度（opti⁃cal density，OD）值。每次实验重复3次，每组3个复孔。

1.3.3 Hoechst 33342细胞荧光染色

转染48 h后，将各组786⁃O细胞制备成1×105个/mL浓度细胞混悬液。取2 mL细胞混悬液加入6孔板（底部置入1张清洁载玻片）中，将6孔板置入细胞培养箱。48 h后将爬满细胞的玻片用PBS清洗3次，然后用4%多聚甲醛固定1 h。再次将玻片用PBS清洗3遍。然后将玻片浸泡在装有Hoechst33342染液的染色缸中10 min。荧光显微镜（×100）下，随机选取5个视野计数。活细胞呈弥散均匀荧光，凋亡细胞核或细胞质内可见浓染致密的颗粒块状荧光，3个或3个以上的DNA荧光碎片被认为是凋亡细胞［6］。

1.3.4 裸鼠成瘤实验

取经过siRNA转染后各组细胞2×106个重悬于100 μL PBS，分别皮下接种于裸鼠右前肢腋下。每隔5天，用游标卡尺测量肿瘤长（L）和宽（W），瘤体体积计算公式为LW2/2（mm3）。初始每组11只裸鼠，第7天时，SOX9沉默组有一只裸鼠因注射部位感染而死亡，对照组有一只裸鼠从始至终未长出肿瘤。第20天时处死裸鼠，仔细分离瘤体并称重。瘤体组织用于后续免疫组化实验。

1.3.5 免疫组织化学染色

新鲜的肿瘤组织从裸鼠体内分离后立即用4%多聚甲醛溶液行标本固定。然后经酒精梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，用切片机切成厚约4 μm的组织薄片。经二甲苯及梯度酒精处理予以脱蜡至水化。滴加Ki⁃67抗体孵育过夜，二抗孵育1 h。行二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色，苏木精染色后中性树脂封片。在普通显微镜下，随机取5个40倍高清视野计数总的细胞数目及Ki⁃67阳性细胞数目，其中细胞核为棕褐色即视为 Ki⁃67 染色阳性。Ki⁃67 阳性细胞比例=Ki⁃67 阳性细胞数目/总细胞数目×100%。

1.3.6 平板克隆形成实验

将转染了siRNA的786⁃O细胞制成单细胞混悬液，以1 000个/孔的密度接种于普通6孔板。将六孔板置于细胞孵箱中，每两天更换一次新鲜培养基。14天之后，将细胞用4%多聚甲醛固定，0.5%结晶紫染色。普通显微镜（×100）下随机取5个视野，并计数大于100个细胞的细胞集落数。实验重复3次，每组3个复孔。

1.4 数据统计学处理

所有数据处理均采用SPSS 13.0软件。计量资料表达形式为均数±标准差（±s），两组间的比较采用student⁃t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 沉默SOX9基因的表达影响786⁃O细胞的活性

转染48 h后，相对于对照组而言，沉默组中SOX9mRNA的表达水平显著降低，干扰效率为83.8%（图1A）。同时转染48 h及72 h后，SOX9沉默组的细胞活性相对于对照组显著降低（P＜0.05）（图1B）。

图1 干扰沉默SOX9基因对786⁃O细胞活性的影响Figure 1 Effects of SOX9 siRNA on cell viability of 786⁃O cells

2.2 沉默SOX9基因的表达抑制786⁃O细胞的增殖，促进细胞凋亡

平板克隆形成实验结果显示，肾癌786⁃O细胞转染SOX9siRNA后，SOX9沉默组的细胞集落数为（140.0±11.52）个，显著低于对照组的细胞集落数（323.3±14.51）个（P＜0.05）（图2A和图2B）。Hoechst 33342细胞荧光染色结果显示，SOX9沉默组细胞凋亡比例为（27.7±3.25）%，显著高于对照组细胞凋亡比例（6.0±0.94）%（P＜0.05）（图3A和图3B）。

2.3 沉默SOX9基因的表达抑制786⁃O细胞裸鼠成瘤能力。

将SOX9siRNA转染后的786⁃O细胞及其对照组细胞分别接种到BALB/c裸鼠体内，观察其成瘤能力。在第20天实验结束时，SOX9沉默组平均瘤体体积为（315.44±63.73）mm3，明显小于对照组平均瘤体体积（595.2±50.52）mm3（图 4A）。同时SOX9沉默组平均瘤体重量为（0.43±0.23）g，显著低于对照组的平均瘤体重量（0.89±0.16）g（P＜0.05）（图 4B）。Ki⁃67 免疫组织化学染色结果如图5所示，SOX沉默组Ki⁃67阳性的细胞比例为（13.3±2.66）%，显著低于对照组肿瘤组织中Ki⁃67阳性的细胞比例（56.3±3.21）%（P＜0.05）。

图2 干扰沉默SOX9基因对786⁃O细胞增殖的影响Figure 2 Effects of SOX9 siRNA on 786⁃O cells proliferation

图3 沉默SOX9基因对786⁃O细胞凋亡的影响Figure 3 Effects of SOX9 siRNA on 786⁃O cells apoptosis

3 讨论

肾细胞癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤，手术切除结合分子靶向药物是其主要的治疗方法。但是肾细胞癌的发生发展是一个多因素、多基因参与的过程，部分肾癌患者对现有的分子靶向药物治疗并不敏感。所以寻找新的分子靶点，对于肾癌的治疗具有重要的意义。

图4 干扰沉默SOX9基因对786⁃O细胞裸鼠成瘤能力的影响Figure 4 Effects of SOX9 siRNA on 786⁃O cells tumorigenesis in nude mice

图5 干扰沉默SOX9基因对786⁃O细胞Ki⁃67蛋白表达的影响Figure 5 Effects of SOX9 siRNA on Ki⁃67 protein expression in 786⁃O cells

SOX基因超家族参与人体众多重要的生理过程，如决定性别、调节胚胎神经系统发育、参与软骨形成、晶状体的发育、血细胞生成等等［7⁃8］。近年来相关研究表明，SOX基因家族与人类肿瘤关系密切，如SOX2基因通过调节PTEN的表达，抑制胃癌细胞的增殖和转移［9］。SOX6基因在肝癌组织中表达明显降低，且低表达SOX6基因的患者预后较差［10］。口腔鳞状细胞癌患者的SOX7低表达与其淋巴结转移、肿瘤高分级分期密切相关，抑制SOX7的表达能够降低口腔鳞状上皮癌细胞增殖及侵袭能力［11］。SOX9基因表达异常升高可导致结直肠癌的发生［3］，且在肺癌和胰腺癌组织中表达丰富，参与调节其相应肿瘤细胞的转移［4⁃5］，此外也与乳腺癌的预后密切相关［12］。SOX9表达增强能够促进脑胶质瘤细胞的转移［13］，而沉默SOX9基因的表达能抑制宫颈癌细胞的增殖［14］。此外，在前列腺癌中SOX9发挥抑癌基因的作用，低表达SOX9基因与ERG阳性的前列腺癌复发、转移密切关联［15］。有报道称SOX9在相应的肾细胞癌组织中呈高表达，与其预后密切相关［16］。但涉及SOX9基因的表达对肾细胞癌细胞功能的相关影响仍未见报道。

为探究SOX9对肾细胞癌786⁃O细胞增殖的影响，本研究采用CCK⁃8检测siRNA干扰沉默SOX9基因表达对细胞活性的影响。实验结果表明，沉默SOX9表达后786⁃O细胞活性显著下降。同时，相应的平板克隆形成实验和Hoechst 33342细胞荧光染色结果进一步显示，干扰沉默SOX9能显著抑制786⁃O细胞的增殖，促进其凋亡增加。早期研究表明，在体外敲除SOX9基因能够显著抑制甲状腺癌、直肠癌及胃癌等细胞的增殖［3，17⁃18］，促进脊索神经瘤细胞凋亡［19］；此外，敲除骨肉瘤细胞系SOX9基因的表达既能导致细胞增殖被抑制，同时也能促进其细胞凋亡［20］。本研究结果与上述文献报道结果基本吻合。

此外，为进一步了解沉默SOX9基因对体内肾癌细胞增殖的影响，本研究将细胞接种于裸鼠体内观察肿瘤体积及重量的变化。结果表明，SOX9沉默组肿瘤体积与肿瘤重量均低于对照组。Ki⁃67是一种与细胞周期相关的蛋白质，其功能与有丝分裂密切相关，在细胞增殖中不可缺少，该蛋白高表达反应细胞增殖能力强，是一个常用的细胞增殖抗原［21］。数据显示，沉默SOX9基因后，增殖抗原Ki⁃67的表达显著被抑制。提示沉默SOX9基因同样能够抑制体内肾细胞癌786⁃O细胞的增殖，与其体外实验结果一致。

综合上述研究结果，干扰沉默SOX9的表达能够显著抑制肾细胞癌786⁃O细胞的增殖，并促进该细胞凋亡。同时证明在体外及动物体内靶向抑制SOX9基因表达能够有效地杀伤肾细胞癌相关细胞系，进一步为肾细胞癌的临床治疗提供参考。

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