新型多重不对称PCR⁃电化学芯片法检测甲型流感病毒

蒋析文 黄桃生 黄志文 张险朋 殷三鸿

甲型流感是由甲型流感病毒（influenza A vi⁃rus）引起的一种人畜共患的疾病综合症。目前许多甲型流感病毒如 H1N1、H3N2、H5N1、H9N2、H7N9 等［1⁃2］均由禽类传播到人类中，容易引起极高的死亡率，导致严重的公共卫生事件。监测是确定甲型流感流行株、发现变异株、预测和防控疫情的基础［3⁃4］。甲型流感病毒的检测方法多种多样，主要包括病毒分离培养、血清学检测及核酸检测［5］。作为流感病毒检测的传统方法，病毒培养和血清学检测灵敏度、特异性、准确性均较低，且操作繁琐，检测周期长。核酸分子检测凭其高特异性及高灵敏度，正逐步取代传统方法，广泛用于甲型流感病毒的检测中，其主要方法包括逆转录荧光定量PCR、芯片及高通量测序技术等。然而，目前所有针对甲型流感病毒的核酸检测均以3～4个型为主，完整的分型检测几乎空白。

本研究根据利用中山大学达安基因股份有限公司自主研发的电化学芯片核酸检测系统，针对甲型流感病毒的血凝素（hemagglutinin，HA）和神经氨酸酶（neuraminidase，NA）常见型别 H1、H3、H5、H7、H9、H10和 N1、N2、N6、N8、N9的基因序列，建立一种基于多重不对称PCR⁃电化学芯片技术同时检测多种甲型流感病毒型的新分子诊断方法，并对200例流感样动物咽拭子样本进行检测及测序验证，对甲型流感病毒的临床诊断和治疗具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

c⁃MMLV 反转录酶、热启动 Taq酶、Rnasin、dNTP均购自美国Promega公司，ABI 9700 PCR仪、ABI 7500 Real⁃time PCR 仪购自美国ABI公司，DA9100电化学基因传感器检测系统（DA⁃01⁃004）和核酸提取或纯化试剂（磁珠法）（货号：Cat.#DA⁃512）及甲型流感相关荧光定量PCR检测试剂盒均来自于中山大学达安基因股份有限公司。

1.2 临床样本

H1N1、H3N2、H5N1、H5N6、H7N9、H9N2、H10N8乙型流感病毒、丙型流感病毒、呼吸道合胞病毒标准病毒株、250例动物咽拭子临床样本（200例甲型流感阳性、50例阴性）均由东莞动物疾病预防控制中心提供。

1.3 引物与探针

根据https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/Database/nph⁃select.cgi流感数据库中提供的基质蛋白（matrix protein，MP）、H1、H3、H5、H7、H9、H10和 N1、N2、N6、N8、N9的基因序列，下载并比对分析后，利用生物软件Oligo 7.0分别在其保守区设计引物和探针，并通过NCBI数据库进行Blast同源性比对验证，其中HA和NA序列的下游引物采用通用引物进行扩增，MP序列采用特异性引物进行扩增（MP⁃sense，MP⁃Anti⁃sense）。引物和探针均由上海生工生物股份有限公司合成，捕获探针（capture probe，CP）采用C6 S⁃S标记，信号探针（signal probe，SP）采用二茂铁（Fc）标记，具体序列特征和探针标记见表1和表2。

表1 甲型流感病毒分型引物的核酸序列Table 1 Sequences of influenza A virus genotyping primers

表2 甲型流感病毒分型探针的核酸序列Table 2 Sequences of influenza A virus genotyping probes

1.4 病毒基因组核酸提取和PCR扩增

标准病毒株及咽拭子样本核酸的提取采用中山大学达安基因股份有限公司生产的核酸提取或纯化试剂（磁珠法），按试剂盒说明书进行操作。提取后的核酸置于⁃20℃冰箱中，并通过甲型流感相关荧光定量PCR检测试剂盒（中山大学达安基因股份有限公司）标定其浓度。甲型流感多重不对称PCR采用50 μL反应体系，其中主要包含MgCl2（10 mmol/L），KCl（50 mmol/L），12 条上游引物（每条用量3 pmol），3条下游引物（每条30 pmol）以及20 μL扩增模板。采用ABI 9700 PCR仪中进行扩增，反应条件：50℃30 min，95℃15 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，45个循环；72℃7 min。PCR扩增结束后，由于采用的不对称PCR方法上下游引物用量不对等，扩增完成后产生大量的单链DNA（ssDNA），所以杂交检测前扩增产物（50 μL）无需经过高温变性即可直接与信号探针（100 μmol/L）、新生牛血清（10 μL）及高氯酸钠（20 μL）进行杂交，于DA9100电化学基因传感器检测系统中检测。

1.5 多重不对称PCR⁃电化学芯片法

采用的电化学基因芯片表面有72个金电极，捕获探针分别固定在特制的印刷电路板金电极表面，制备成电化学芯片，用于捕获PCR多重扩增产物，信号探针与已被捕获的PCR产物特异结合。同时，在电极上施加交流电压，刺激信号探针上的二茂铁分子发生氧化还原反应，通过检测电流值来判定结果阴阳性。

1.5.1 特异性测定

利用确定的PCR⁃电化学芯片法体系分别对灭活的乙型流感病毒、丙型流感病毒、呼吸道合胞病毒及甲型流感 H1N1、H3N2、H5N1、H5N6、H7N9、H9N2、H10N8病毒核酸进行检测，评价其特异性。

1.5.2 灵敏度测定

将己标定浓度的甲型流感H1N1、H5N1、H5N6、H7N9的核酸进行梯度稀释，检测其灵敏度。

1.5.3 临床样品检测

利用本研究所建立的多重不对称PCR⁃电化学芯片法，对通过中山大学达安基因股份有限公司生产的甲型流感通用型荧光定量PCR检测试剂盒检测阳性的200例甲型流感样本核酸及50例阴性样本核酸进行检测，并通过本公司生产的甲型流感荧光 PCR 检测试剂盒（H1N1、H5N1、H7N9、H9N2等）进行对照验证，对比方法的一致性。

1.6 统计学分析

通过kappa检验分析多重不对称PCR⁃电化学芯片法和荧光定量PCR法检测结果的一致性。

2 结果

2.1 PCR⁃电化学芯片法检测特异性

检测试剂可以准确检测出甲型流感各型别病毒核酸并且未出现错检、漏检等情况，而乙型流感病毒、丙型流感病毒以及呼吸道合胞病毒核酸等未出现假阳性结果。

2.2 PCR⁃电化学芯片法检测灵敏度

将 H1N1、H5N1、H5N6、H7N9病毒株的核酸进行梯度稀释，直至电化学芯片法无法检出为止，结果显示当核酸浓度低于1×103copies/mL时，则H1N1和H5N6未见电化学信号产生，而H5N1和H7N9在100 copies/mL时出现漏检。因此，确定该方法灵敏度可达约1×103copies/mL。

2.3 临床样本检测结果及统计学分析

采用本研究所建立的多重不对称PCR⁃电化学芯片法对200例甲型流感阳性临床样本以及50例阴性样本进行检测，并采用中山大学达安基因股份有限公司生产的对应型别荧光定量PCR检测试剂盒进行对照验证，结果显示200例甲型流感阳性临床样本中，多重不对称PCR⁃电化学芯片法检出194例阳性，其中6例漏检，敏感率为97%，50例阴性样本检测均为阴性，特异度为100%，kappa分析结果为0.928（P＜0.000 1）显示2种方法一致性高，差异具有统计学意义，见表3。

表3 PCR⁃电化学芯片和荧光PCR检测结果比较Table 3 The detection outcomes of PCR⁃electrochemical chip and real⁃time PCR

具体到不同型别，电化学方法与荧光定量法比较，结果显示H9N2 82例，H5N6 56例，H5N1 16例，H3N2 6例，H10N8 5例未出现漏检情况，H7N9 27例（电化学漏检4例），H1N1 8例（电化学漏检2例），通过分析荧光定量Ct值，发现这6例样本浓度均低于电化学方法确定的最低检出限，结果见图1。

图1 各型别PCR⁃电化学芯片与荧光定量PCR样本检出比较Figure 1 The detection outcomes of PCR⁃electrochemical chip and real⁃time PCR

3 讨论

目前已有大量研究［6⁃8］通过逆转录荧光定量PCR检测甲型流感病毒通用型、H1N1、H3N2、H7N9等，其灵敏度和特异性均非常高但需根据Ct值来判断结果，且由于荧光通道数目限制，单管体系最多能检测4～5种型别，同时对荧光PCR仪器要求较高，通道过少大大限制了其在分型检测中的应用，故至少需要3管体系才能完成所有常见型甲型流感病毒的检测。荧光定量PCR技术要广泛用于多重分型检测中，目前要解决的关键问题就是仪器本身对各通道的兼容性。相比荧光PCR，本文方法仅通过单管体系即可完成所有分型检测，优势明显。

微阵列芯片法［9⁃10］和高通量测序技术（next⁃generationse quencing，NGS）［11⁃12］也被广泛用于甲型流感病毒检测中。微阵列芯片技术先进，通量高，但其价格昂贵，劳动密集，耗时较长，且容易受到污染，检测灵敏度及特异性易受各种因素影响，重复性差，也容易出现假阴性。如若微阵列芯片技术能在操作性方面更加自动化，成本方面得到进一步控制，相信其一定会成为未来核酸检测领域的趋势之一。相比微阵列芯片法，电化学基因芯片仅需一步分子杂交，2 h内即可完成检测，且结果显示良好的重复性、准确性及高度特异性。而NGS技术是由几个特定制造商的平台、不同的测序方法、试剂和生物信息学软件组成，构成复杂，成本高，其结果分析必须通过特定生物信息学软件完成，复杂繁琐，耗时较长，但在通量及挖掘病毒深层信息方面，NGS具有独特优势。作为国内外分子检测的最热点与最前沿技术，NGS备受关注，然而，本身复杂的生物信息学软件及居高不下的成本大大制约了其更加广泛的应用。相比NGS，本方法的优势在于检测结果以PDF形式呈现，简洁明了，且成本较低。

本研究根据 https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/ge⁃nomes/FLU/Database/nph⁃select.cgi流感数据库中提供的几乎所有 MP、H1、H3、H5、H7、H9、H10 和N1、N2、N6、N8、N9的基因序列进行比对分析后，分别在其保守区设计特异性上游引物，并参照相关研究［13］确定2条通用引物作为下游引物，而针对MP设计特异性引物通过优化最终建立可同时检测甲型流感病毒 MP、H1、H3、H5、H7、H9、H10和 N1、N2、N6、N8、N9的单管多重不对称 PCR⁃电化学芯片法，经过对比实验，其检测灵敏度可达1×103copies/mL，且同时具有较高特异性和准确性。因此，我们完全有理由相信新构建的电化学基因芯片方法在甲型流感病毒分型筛查中一定可以发挥很好的作用。

基因序列的重组、插入、缺失以及突变导致甲型流感病毒经常发生变异，如 H7N9［14］、H9N2［15］等，这使得针对其进行分型检测变得异常困难。因此，我们将密切关注甲型流感病毒最新信息，及时更新试剂，为临床诊断和治疗奠定基础。

参考文献

［1］Mgbere O，Ngo K，Khuwaja S，et al.Pandemic⁃relat⁃ed health behavior：repeat episodes of influenza⁃like illness related to the 2009 H1N1 influenza pandemic［J］.Epidemiol Infect，2017，145（12）：2611⁃2617.

［2］Pulit⁃Penaloza JA，Simpson N，Yang H，et al.Assess⁃ment of molecular，antigenic，and pathological fea⁃tures of canine influenza A（H3N2） viruses that emerged in the United States［J］.J Infect Dis，2017，216（suppl_4）：S499⁃S507.

［3］Si YJ，Choi WS，Kim YI，et al.Genetic characteris⁃tics of highly pathogenic H5N8 avian influenza viruses isolated from migratory wild birds in South Korea dur⁃ing 2014⁃2015［J］.Arch Virol，2016，161（10）：2749⁃2764.

［4］Peeters B，Reemers S，Dortmans J，et al.Genetic ver⁃sus antigenic differences among highly pathogenic H5N1 avian influenza A viruses：Consequences for vaccine strain selection［J］.Virology，2017，503（1）：83⁃93.

［5］Vemula SV，Zhao J，Liu J，et al.Current approaches for diagnosis of influenza virus infections in humans［J］.Viruses，2016，8（4）：96.

［6］Mohammad AB，Mazyar Z，Abdolvahab A.A diag⁃nostic one⁃step real⁃time reverse transcription poly⁃merase chain reaction method for accurate detection of influenza virus type A［J］.Arch Med Sci，2016，12（6）：1286⁃1292.

［7］Cui D，Zhao D，Xie G，et al.Simultaneous detection of influenza A subtypes of H3N2 virus，pandemic（H1N1）2009 virus and reassortant avian H7N9 virus in humans by multiplex one⁃step real⁃time RT⁃PCR as⁃say［J］.Springerplus，2016，5（1）：2054.

［8］Zadeh VR，Jagadesh A，Krishnan A，et al.Detection of D151G/N mutations in the neuraminidase gene of in⁃fluenza A（H3N2）viruses by real⁃time RT⁃PCR allel⁃ic discrimination assay［J］.J Med Virol，2017，89（7）：1174⁃1178.

［9］Zhang Y，Liu Q，Wang D，et al.Genotyping and de⁃tection of common avian and human origin⁃influenza viruses using a portable chemiluminescence imag⁃ing microarray［J］.Springerplus， 2016，5（1）：1871.

［10］Fei Y，Sun YS，Li Y，et al.Characterization of recep⁃tor binding profiles of influenza A viruses using an el⁃lipsometry ⁃based label⁃free glycan microarray assay platform［J］.Biomolecules，2015，5（3）：1480⁃1498.

［11］Li D，Li Z，Zhou Z，et al.Direct next⁃generation se⁃quencing of virus⁃human mixed samples without pre⁃treatment is favorable to recover virus genome［J］.Bi⁃ol Direct，2016，11（1）：3.

［12］Seong MW，Cho SI，Park H，et al.Genotyping influ⁃enza virus by next⁃generation deep sequencing in clini⁃cal specimens［J］.Ann Lab Med，2016，36（3）：255⁃258.

［13］Inoue E，Wang X，Osawa Y，et al.Full genomic am⁃plification and subtyping of influenza A virus using a single set of universal primers［J］.Microbiol Immu⁃nol，2010，54（3）：129⁃134.

［14］Dai M，McBride R，Dortmans JC，et al.Mutation of the second sialic acid⁃binding site，resulting in reduced neuraminidase activity，preceded the emergence of H7N9 influenza A virus［J］.J Virol，2017，91（9）：e00049⁃17.

［15］Liu YF，Lai HZ，Li L，et al.Endemic variation of H9N2 avian influenza virus in China［J］.Avian Dis，2016，60（4）：817⁃825.