登革热检测技术应用及发展

蒋力云 狄飚 杨智聪

登革热（dengue fever，DF）是由登革病毒（den⁃gue virus）引起的急性传染病，广泛流行于热带和亚热带地区，临床表现以高热、头痛、肌肉关节疼痛为主，有时伴有皮疹、淋巴腺肿大和白细胞减少等症状，重症患者会出现登革出血热（dengue hem⁃orrhagic，DHF），甚至登革休克综合征（dengue shock syndrome，DSS）。在我国，登革热自1978年在广东佛山暴发流行以来，主要流行于广东、广西、福建、浙江及海南等省［1⁃2］，已经成为我国面临的严峻的公共卫生问题。由于半数以上的登革热病例无症状或者仅出现普通的发热症状［3⁃4］，因此仅从临床症状上来判断登革热比较困难，实验室的辅助诊断显得尤为重要。只有尽早快速准确地诊断疾病，才能对急性期患者进行早报告、早隔离、早就地治疗，并且及时开展蚊媒的灭杀工作，才有利于登革热疫情的控制。这也促使登革热检测技术不断进步和提高，检测方法更加简便、快速、准确。近年来在免疫学检测、病原检测、病毒分离培养技术等方面取得了一定进展，为临床检测不同发病阶段的登革热提供了更多的选择和有效的检测方法，有效地提高了登革热检测的灵敏度和准确度。

1 登革病毒检测程序新进展

登革病毒感染后，患者除了出现白细胞降低、血小板减少、血液浓缩和低蛋白血症等非特异性的血象改变外［5］，还能从相关临床标本中检测到特异性抗体、病毒抗原、病毒核酸甚至分离到病毒。登革热检测所采集的临床病例标本可以包含血液、脑脊液、脑组织和肝［6］。因为在标本采集过程中，血液的采集和处理最方便，对患者造成的创伤和损害最小，几乎在整个感染期间血液都能用于检测，因此登革热检测中采集的病例标本普遍以血液为主。脑组织和肝主要是在尸检或动物实验时采集，通常需要在研磨破碎后用于病毒分离或者核酸检测，或者冰冻切片后进行免疫荧光检测。在国内外一些相关研究中，也有采集唾液和尿液进行检测，但是由于受到排毒量少和排毒时间短的限制，很少在日常检测中采用［7］。在临床检测中，采用血清检测登革病毒及抗体的步骤如图1所示。根据血清采集时对应的发病时间，选择灵敏度较高的检测方法，有利于提高登革热检测效率。如在发病早期，通常是7天内，特别是出现发热症状的5天内［8］，使用NS1检测、核酸检测或者病毒分离的方法相较于通过抗体检测的方法检测更有优势。而在发病后期，我们更倾向于通过检测血清中抗体滴度的变化，特别是IgG的4倍增高来判断登革病毒的感染。

图1 血清中检测登革病毒及抗体流程图［9］Figure 1 Procedure of dengue virus and antibody detection in serum［9］

2 登革病毒快速检测技术的运用

2.1 抗体检测

由于抗体检测技术操作简便，所需仪器设备简单，商品化试剂易于购买，是目前诊断登革热的重要手段。但是登革病毒抗体与其他黄病毒抗体存在交叉反应，加之我国将乙型脑炎预防接种作为计划免疫的一部分，因此在检测过程中需要注意非特异性反应，同时结合患者临床症状和流行病学史对抗体阳性结果加以区分。

抗体检测样品以血液为主，主要是针对IgM和IgG进行检测。在首次感染时，出现发热后大概5天，IgM就能被检测到并且能在体内持续2～3个月；而IgG则出现在发热后的8～10天，并能在体内持续存在4个月。而在二次感染时，IgG在发热后快速升高，某些病例中甚至无法检出IgM，而IgG在10 个月后仍然能检测到，甚至持续终身［3，8］。有报道通过IgM/IgG的比值来判定病例是首次感染或是二次感染，但该比值无统一标准，并且受采样时间的影响较大，因此在判定时需谨慎，以免造成误判［10⁃11］。也有文献研究通过检测血液、唾液和尿液中IgM、IgG、IgE和IgA，以此来诊断登革病毒感染［7］。但是总体来说，多数实验室仍然是以检测血清中IgM和IgG为主要方法。并且我国《登革热诊断标准》（WS216⁃2008）也包括以血清中特异性IgM或IgG阳性或双份血清特异性IgG的4倍增高为诊断依据。

抗体检测方法包括血凝抑制试验（hemaggluti⁃nation⁃inhibition test，HI）、补体结合试验（comple⁃ment fixation test，CFT）、中和试验（neutralization test，NT）、酶联免疫吸附试验（enzyme linked immu⁃nosorbent assay，ELISA）、胶体金免疫层析快速试验 （immunochromatographiccolloidalgold test，ICT）、免疫斑点法（dot immunobinding assay，DI⁃BA）和间接免疫荧光试验（indirect immunofluores⁃cence assay，IFA）等。

其中，HI和CFT是较古老的血清学检测方法。前者是根据登革病毒能使鹅的红细胞发生凝集，但在特异性抗体存在的情况下凝集现象会被抑制的原理来检测样本中登革病毒抗体。用HI试验检测抗体时，登革病毒和其他黄病毒之间存在较高的交叉反应。用CFT检测抗体的时间，较用HI检测抗体的时间晚，且持续时间不长。在初次感染时，CFT有较好的特异性，而二次感染时的特异性不好。CFT参与反应的成分较多，影响因素比较复杂，较难操作，操作者需要经过严格培训和具备丰富的经验。因此，现在大多数实验室已经放弃将HI和CFT作为登革热的诊断试验。NT能检测出样品中保护性抗体的水平，是抗体检测中的一种敏感方法。但是，标准病毒颗粒的完整性、宿主细胞的敏感性等各因素的变化都会影响其结果的准确性，判断实验结果所需时间也较长，故不适用于快速诊断。同时，NT操作技术要求较高、操作繁琐、耗时长，因此多在研究性工作中使用，不适用于临床大规模检测。IFA是先将病毒感染的细胞固定在玻片上，制备成抗原片，然后加入患者血清，再加上荧光素标记的二抗，作用一定时间后在荧光显微镜下观察结果。该方法可区分感染病毒的血清型，但由于需要使用荧光显微镜，且在结果的判定上对检测人员的经验有一定依赖，因此难以在基层医疗机构建立。

ELISA、ICT和DIBA是目前临床检测登革病毒抗体最常用的方法［12］，在检测过程中需要注意类风湿因子的影响和其他黄病毒的交叉反应。ICT操作简单，人员只需简单培训即可使用，反应所需时间短，不需酶标仪等试验设备，因此特别适合现场快速检测［13］。ICT法检测登革病毒IgM抗体适合在登革热暴发流行期间用作疫区基层医疗单位的早期初筛试验。而ICT法检测登革病毒IgG抗体的灵敏度偏低，可以通过对有持续临床症状的患者再次采样来提高检出率。ELISA由于操作简便，所需仪器设备简单，可同时检测大量标本，并且有多种品牌的商品化试剂提供，因而得到了广泛的推广和应用。ELISA法检测登革病毒IgM/IgG抗体适合在普查及大批量标本检测时使用。在登革热散发期间，ELISA法检测登革病毒抗体会与其他黄病毒抗体产生广泛的交叉反应，出现假阳性结果，需要结合临床症状或其他实验结果做出判断。DIBA法操作费时，成本比较昂贵，检测IgM抗体不适合作为初筛试验，但DIBA法检测IgG抗体敏感性和特异性好，与其他黄病毒交叉反应少，适合在登革热散发期间使用，可作为登革病毒感染的确证实验。

2.2 抗原检测

登革抗原检测方法有HI、CFT、NT、免疫荧光（immunofluorescence，IF）、ELISA 和 ICT 等，主要是针对样品中病毒蛋白或病毒进行检测。登革病毒的基因组结构可以分为5′末端非编码区、结构蛋白编码区、非结构蛋白编码区和3′末端非编码区。

目前，对病毒蛋白的检测主要是针对非结构蛋白NS1检测。血清中的NS1在发病第一天出现，第3天达到峰值，4天内的敏感性为88%～95%，并可持续到第9天［14］。NS1产生于感染早期甚至早于IgM的出现，但是在抗NS1⁃IgG出现后就无法检测。因此，NS1的检测主要是在登革病毒感染早期使用。在发病早期检测NS1和用PCR检测核酸的一致性高达 95%以上［15⁃16］，而 NS1 检测的成本和技术要求都低于PCR检测。因此，在无法开展PCR检测的基层单位开展NS1检测，有利于患者的早期发现和诊断。然而在二次感染时，由于IgG的存在，NS1很快与抗体形成抗原⁃抗体免疫复合物，使得NS1难以检出。不过，通过37℃孵育1 h的方法，使抗原⁃抗体复合物分离开来，可以提高NS1的检出率［17］。主要的商品化检测试剂有酶联免疫吸附试剂和胶体金快速试剂，都有较高的敏感性和特异性［18⁃20］。在广州市，NS1 胶体金快速试剂已经在各大医院推广开展，针对发病早期的检测效果良好［21］。同时我们也发现，进口试剂的准确率明显高于国产试剂［22］。所以，在资金充足的情况下，优先推荐使用进口试剂。

FA是目前实验室鉴定登革病毒的另一种常用方法。FA是将待测样品与登革病毒型特异性单克隆抗体反应，随后加入荧光素标记的抗体，通过荧光显微镜观察结果。研究人员用免疫荧光检测外周血单核细胞登革抗原，发现在退热前阳性率较高［23］。该技术最大优点为敏感性和特异性高，特别是单克隆抗体的问世大大提高了免疫荧光测定的效果，主要应用于快速诊断。

2.3 核酸检测

在登革热发病后2～7天时，登革病毒能在患者血液、血细胞甚至组织，特别是免疫系统组织中检测到，这个时期基本与患者的发热期相吻合。最适宜使用这段时期采集的标本进行登革病毒核酸检测、病毒分离。核酸检测主要是根据登革病毒的基因序列设计特异性引物，在适当的反应体系和条件下进行扩增，最后用仪器设备检测判断。由于不同血清型的登革病毒有不同的基因序列，因此通过核酸检测可以区分登革病毒的血清型。相较于病毒分离，核酸检测的反应时间短、特异性强、敏感性高。但是，由于对仪器设备和操作人员的要求较高，花费大，不适用于大批量的调查监测［24］。特别是核酸检测敏感度较高，因此在操作中需要小心避免因污染造成假阳性。将实验室正确分区，注意阳性对照和阳性样品的妥善保存，以及谨慎地处理核酸扩增产物可以有效降低污染的可能性。又由于登革病毒是RNA病毒，需要避免实验中核酸降解造成假阴性。使用去除RNA降解酶和DNA降解酶的实验器材可以有效地避免RNA降解。这些要求都限制了核酸检测方法在基层工作中的开展和运用。

核酸检测常用的方法包括，核酸杂交检测（hy⁃bridization）、逆转录⁃聚合酶链反应检测（reverse transcription⁃polymerase chain reaction，RT⁃PCR）、实时荧光定量逆转录⁃聚合酶链反应检测（real⁃time fluorescence quantitative reverse transcription⁃polymerase chain reaction，RT⁃qPCR）、基因芯片（gene chip）和核酸等温扩增技术（nucleic acid se⁃quence⁃based amplification，NASBA）等。

核酸杂交检测的原理是双链的核酸分子在某些理化因素作用下解开，在条件恢复后又可依碱基配对规律形成双链结构。杂交通常在一支持膜上进行，因此又称为核酸印迹杂交。但由于该方法操作繁琐、费时费力，已基本不用于登革病毒的核酸检测。在目前临床检测中，最常用的是RT⁃PCR和RT⁃qPCR。在RT⁃PCR检测中，通过对登革病毒不同位点设计特异性引物进行片段扩增，不仅可以检测样品中是否含有登革病毒核酸，还可以判断病毒的血清型，通过进一步的序列测定可以获得病毒的核苷酸序列，从分子生物学角度对病毒的流行和传播进行分析。而使用RT⁃qPCR检测则无法获得病毒的核苷酸序列。但是，RT⁃qP⁃CR相对RT⁃PCR可以实时地观察结果，检测时间短，有更高的灵敏度，并且可以定量测定，加之反应在一个密封的体系里进行，大大地减少了污染的可能性。因此，在对患者的急性期临床标本检测中应用更加广泛。

NASBA是在恒温条件下对病毒核酸进行扩增，扩增产物通过电发光设备用探针杂交的方法检测出来。NASBA可以扩增在人血中含量低至1～10 PFU/mL 的登革病毒［25］。相较于 RT⁃PCR，NASBA在41℃的恒温下进行，不需要温度循环装置；产物是单链RNA，可以直接用于杂交检测，而且RNA较DNA容易降解，减少了阳性产物可能带来的污染问题。在NASBA反应体系中加入分子信标探针，可以实时观测反应结果。相较于RT⁃PCR和RT⁃qPCR，NASBA的简便和快捷更有利于在基层开展和运用。但是，NASBA需要进一步提高其灵敏度。基因芯片的发展时间较短，但是它操作简便、成本低、体积小、高通量，具有广泛的应用前景，并有待进一步研究和推广［26］。

在临床检测中，血清、全血或者血浆是登革病毒核酸检测的常见标本。有研究显示，组织、尿液或者唾液也可以作为临床检测标本。在发病0～5天时，用RT⁃qPCR检测尿液中登革病毒核酸的阳性率低于血清中的阳性率。但是，在发病6～16天，RT⁃qPCR检测尿液中登革病毒核酸的阳性率大幅增加，并且高于血清检测的阳性率。甚至在血清中出现IgM和IgG，在利用血清无法检测出病毒核酸的情况下，尿液检测的阳性率依然保持较高水平［27］。还有报道称，用 RT⁃qPCR 能从唾液中检测出登革病毒核酸［28］。这些都为登革病毒核酸检测提供了更多可能的检测样本。

2.4 病毒分离

由于登革病毒分离的时间长，对样品的要求较高，加之核酸检测技术的发展，在临床检测中已经逐步被核酸检测所取代。但是，病毒分离作为判定登革病毒感染的金标准，能获得毒株进行进一步研究病毒的病原学、表型特征和抗原漂移等，仍然是登革病毒检测的一项重要技术。

登革病毒分离的方法包括乳鼠分离、蚊虫分离和细胞分离。乳鼠分离实验成本较高，对实验室设备要求也较高，并且敏感性不高，因此大多实验室不采用。可以用于蚊虫分离的蚊媒种类有：埃及伊蚊、白纹伊蚊、汉安巨蚊和华丽伊蚊等。登革病毒能在4～5天内在蚊体内复制达到高滴度水平。虽然蚊虫分离是分离登革病毒最敏感的方法，但需要昆虫实验室培育大量的蚊虫用以分离，并且要注意防止感染蚊虫逃逸，因此也是最少使用的方法［29］。

目前最常用的登革病毒分离的方法是细胞分离，常用细胞有：恒河猴肾细胞（Ganges River mon⁃key kidney cells，LLC⁃MK2）、非洲绿猴肾细胞（Af⁃rican green kidney cells，Vero cells）、金黄地鼠肾细胞（Baby Hamster Syrian kidney cells，BHK21）、白纹伊蚊细胞（Aedes albopictus cells，C6/36）和伪盾伊蚊细胞（Aedes pseudoscutellaris cells，AP61）等。样品中的病毒载量是影响登革病毒分离率的关键因素；样品中抗体滴度越低，分离率越高；DHF患者样本比DF患者样本的病毒分离率更低；在发热期间采集样本分离病毒能获得更高的分离率；发病天数与病毒分离率也密切相关，采取发病5天前的样本能提高病毒分离率［30］。因此，尽量采集发病早期的标本进行病毒分离，可以有效提高病毒分离率。由于某些毒株不能引起明显的细胞病变，因此可以结合IFA、RT⁃PCR等方法来鉴定病毒分离结果。随着细胞培养和病毒分离技术的发展，有研究通过在同一细胞瓶中培养不同细胞，可以同时分离鉴定不同病毒，或者使用基因改造的细胞来分离病毒［31］。虽然这些方法尚未在病毒分离中推广运用，但为登革病毒分离提供了借鉴。

3 结语

登革热检测方法多种多样，商品化的检测试剂也琳琅满目。近年来，使用胶体金免疫层析快速试验检测登革病毒抗原和抗体，由于其具有操作简便、价格相对低廉、无需专用仪器、无需特殊培训、检测结果直观和现场使用方便等优点，在基层单位得到了广泛的应用和推广。同时，随着对病毒的研究更加深入和细致，检测方法和技术不断更新，检测样品更加多样化。在患者的不同时期，采用不同的检测方法，甚至是联合使用多种检测方法，既有助于排除假阳性的检测结果，避免交叉反应结果，又有利于提高检测结果的灵敏度。同时，从检测结果的灵敏度和特异性上对我国市场上存在的登革热检测商品化试剂进行比较，不同品牌的试剂存在差异。比如，在实际工作中发现，进口NS1检测试剂的特异性高于国产NS1检测试剂，但是国产试剂的灵敏度高于进口试剂［32⁃33］。然而，国家缺乏相关的规范标准对试剂的选择进行指导，这就可能造成采用相同检测方法却使用不同试剂的医院对临床标本做出不同的判断。因此，希望国家能制定相关的工作标准，对检测工作中试剂的选用进行指导，用以规范检测诊断。

通过对各种方法进行比较，笔者认为根据不同时期和实验目的选择不同的实验方法，才能有效地检测和发现登革热。NS1检测、核酸检测和病毒分离在发病早期的敏感度较高，而在血液中抗体存在的时间较长，有利于进行大规模的流行病学调查。在患者的早期检测中，我们倾向于选用敏感性高、快速、简便、价廉以及能将登革热与其他具有相似临床症状的疾病区分开来的实验方法，如NS1和核酸检测。而在疫情暴发和流行中的监测，我们则倾向于选择特异性高，高通量，能在疫情的早期发现患者以及确定流行毒株血清型的方法。在2014年登革热流行中，广州市在基层医院使用胶体金快速试剂筛查登革病毒NS1和IgM/IgG，广州市疾病预防控制中心进一步对阳性标本进行酶联免疫吸附法检测、核酸检测和病毒分离，都取得较好结果，有力地支持了全市的疫情防控工作。相信随着科技的发展和研究的深入，复合运用多重手段，准确、快速地检测登革病毒，及早发现登革热患者，将会极大地提升登革热防控的成效。

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