阿必鲁肽调节2型糖尿病大鼠糖脂代谢及下丘脑SOCS-3、NF-κB mRNA表达水平

孙晶波

阿必鲁肽是被美国食品药品管理局(FDA)批准的第3个长效胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体激动剂[1]，可以明显降低成年2型糖尿病(T2DM)患者血糖水平，且所致低血糖风险低，勿需频繁给药，患者依从性好，有较高安全性和临床疗效[2-4]。目前，国内外对于阿必鲁肽的临床报道较多，结论较积极和一致，但对阿必鲁肽临床作用的机制研究相对较少，尤其在国内。因此本文通过T2DM大鼠模型观察阿必鲁肽对其糖脂代谢及下丘脑细胞因子信号传导抑制蛋白-3(Suppressor of Cytokine Signaling-3，SOCS-3)、核转录因子Kappa B(Nuclear Transcription Factor Kappa B，NF-κB) mRNA表达的影响，验证其作用和机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

40只雄性SD大鼠，SPF级，体质量220-230g，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，动物许可证号：SCXK(京)2014-0008。

1.2 主要药物、试剂与仪器

主要药物和试剂：阿必鲁肽注射液(南京莱昂生物科技有限公司，批号：GTX88237-PEP，10mg/支)；利拉鲁肽注射液(丹麦诺和诺德公司，国药准字J20160037，3ml：18mg(预填充注射笔)/盒，批号：CP50925)。链脲佐菌素(STZ,大连美仑生物技术有限公司，批号：MB1227)。高脂造模纯化实验动物饲料(江苏美迪森生物医药有限公司，批号：1001013401)；Trizol 裂解液(北京凯瑞基生物科技有限公司，批号：15596)；反转录试剂盒和qPCR试剂盒(日本，Takara)；空腹血糖(FBG)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)检测试剂盒(均购自北京雅安达生物技术有限公司，批号分别为：YADC194、YADC194)。仪器：全自动酶免分析仪[Freedom EVOlyzer 100 型，帝肯(上海)贸易有限公司提供]；荧光定量PCR仪(QuantStudio 3型， 美国赛默飞公司生产)。

1.3 复制T2DM模型[5]

40只SD大鼠适应性饲养1周后，随机选择30只一次性腹腔注射10%STZ(30mg/kg)，并给予上述造模大鼠饲料喂养1周后禁食12h，抽取尾静脉血，用氧化酶法，应用自动生化仪检测FBG。成模标准：FBG>16.7mmol/L。30只大鼠全部造模成功。

1.4 分组与给药

采用随机数字表法将成模大鼠随机分为T2DM组、阳性对照药物利拉鲁肽组(利拉鲁肽组)及观察药物阿必鲁肽组(阿必鲁肽组)，每组10只，未经造模处理的另10只大鼠作为正常对照组。利拉鲁肽组腹腔注射利拉鲁肽0.4mg/kg(溶于0.2ml生理盐水)，每天1次；阿必鲁肽组腹腔注射阿必鲁肽2.8mg/kg(溶于0.2ml生理盐水)，每周1次[6],连续注射14周。正常对照组及T2DM组给予同等剂量生理盐水腹腔注射。继续上述饲料喂养至第7周末，检测各组大鼠糖脂代谢指标。继续饲养至第14周末，检测下丘脑组织中SOCS-3、NF-κB mRNA表达水平。

1.5 检测指标和方法

1.5.1血糖、血脂：给药7周大鼠禁食12h后，于次日晨抽取尾静脉血，离心，分离上层血清，采用全自动生化分析仪分别常规测定FBG、TC、TG和LDL-C、HDL-C水平。

1.5.2SOCS-3、NF-κB mRNA：给药14周大鼠禁食12h后断头处死，剥离下丘脑组织，参照相关文献[6，7]，采用实时荧光定量(qPCR)法检测其SOCS-3、NF-κB mRNA表达水平。提取下丘脑组织中总RNA， 逆转录合成 cDNA ，qPCR反应条件，SOCS3: 95 ℃预变性2 min; 95℃ 15s， 60℃30s， 72℃ 30s， 40 个循环; NF-κB 的PCR条件为：94℃预变性5min；94℃ 30s，56.4℃ 30s，72℃ 20s，共35个循环。引物序列，SOCS-3 ：5’-TCA CCC ACA GCA AGT TTC C-3’、5’-TCC AGT AGA ATC CGC TCT CC-3’; NF-κB：5’-GAG AGC CCT TGC ATC CTT TA-3’、5’-CTT CCC TTT GGT CTT TCT GT-3’，内参β-actin：5’-CCT CTA TGC CAA CAC AGT GC-3’、 5’-AAG GGT GTA AAA CGC

AGC TC-3’，均由上海基康生物科技公司合成。 PCR结果用扩增产物的荧光信号达到设定阈值时的循环次数(Ct 值)表示并据此计算SOCS3和NF-κBmRNA相对表达量，F=2-△△Ct；△Ct= Ct(目的基因)- Ct(内参基因)；△△Ct=△Ct(实验组)-△Ct(对照组)。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠血糖、血脂水平比较

四组大鼠FBG、TC、TG、LDL-C和HDL-C血清水平比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。T2DM组FBG、TC、TG、LDL-C水平均显著高于正常对照组(t=28.473、8.581、12.953、9.021，P<0.01)，HDL-C低于正常对照组(P<0.05)。利拉鲁肽组FBG较T2DM组显著降低(t=4.619，P<0.01)，而血脂各指标两组间无明显差异(t=1.213、0.987、1.103、0.686，均P>0.05)。阿必鲁肽组与T2DM组比较，其FBG、TC、TG、LDL-C显著降低(t=7.576、2.702、2.469、2.491，均P<0.05或<0.01)，而HDL-C无明显差异(t=0.000，P>0.05)。阿必鲁肽组FBG水平低于利拉鲁肽组(t=3.290，P<0.01)，两组血脂指标未见统计学差异(t=1.961、1.677、1.627、0.735， 均P>0.05)。见表1。

表1 各组大鼠FBG和血脂水平比较均=10)

注：与正常对照组比较，1)P<0.05,2)P<0.01;与T2DM组比较，3)P<0.05,4)P<0.01；与利拉鲁肽组比较，5)P<0.01

2.2 各组大鼠下丘脑SOCS-3、NF-κB mRNA表达水平比较

四组大鼠SOCS-3、NF-κB mRNA表达水平比较，差异具有统计学意义(P<0.01)。T2DM组SOCS-3、NF-κB mRNA水平均显著高于正常对照组(t=62.225、19.734，P<0.01)。利拉鲁肽组SOCS-3、NF-κB mRNA较T2DM组显著降低(t=32.000、16.971，P<0.01)。阿必鲁肽组与T2DM组比较，其SOCS-3、NF-κB mRNA亦显著降低(t=7.017、8.014，P<0.01)。阿必鲁肽组SOCS-3、NF-κB mRNA低于利拉鲁肽组(t=2.981、3.508，P<0.01)。见表2。

3 讨论

本文结果表明，T2DM大鼠血糖、血脂水平较正常对照组显著升高(HDL-C显著降低)，利拉鲁肽组和阿必鲁肽组大鼠FBG均明显降低，且阿必鲁肽组较利拉鲁肽组下降更为明显，其原因可能是利拉鲁肽作为GLP-1酰化后产物，半衰期较短，而阿必鲁肽是GLP-1二聚体与人白蛋白重组体，半衰期可达5天，作用时间较为持久所致。利拉鲁肽和阿必鲁肽干预T2DM大鼠后，其血清TC、TG、LDL-C水平明显降低，但HDL-C变化不明显，而且两种药物的降脂效果未见统计学差异。即阿必鲁肽对降低T2DM大鼠FBG更有优势。

表2 各组大鼠SOCS-3、NF-κB mRNA表达水平比较均=10)

注：与正常对照组比较，1)P<0.01；与T2DM组比较,2)P<0.01；与利拉鲁肽组比较,3)P<0.01

SOCS-3是Janus激酶信号转导及转录激活蛋白(JAK-STAT)，其在下丘脑弓状核及背内核高表达，可转导瘦素及胰岛素。当发生瘦素、胰岛素抵抗时，下丘脑内SOCS-3 mRNA表达水平明显增加，证实SOCS-3 作为接头分子参与胰岛素抵抗[10，16]。同时提示抑制下丘脑信号通路表达可能有利于某些代谢综合征如DM的治疗[8，9]。本文检测分析了T2DM大鼠SOCS-3和NF-κB mRNA表达水平，结果显示与正常对照组比较，T2DM组大鼠下丘脑SOCS-3 mRNA表达水平明显升高，利用利拉鲁肽及阿必鲁肽干预治疗后，T2DM大鼠下丘脑中SOCS-3 mRNA表达水平显著降低，阿必鲁肽组下降更为明显；也与Pedroso 等[12]的研究结果一致。NF-κB通路的激活可有效抑制下丘脑神经核团内胰岛素和瘦素信号转导，影响神经肽γ等多种神经内分泌激素的分泌及交感神经活性，引起食欲增加及机体能量消耗减少，从而加剧肥胖和相关代谢性疾病的发展。本实验表明与正常对照组大鼠比较，T2DM大鼠下丘脑NF-κB mRNA表达水平明显升高，采用利拉鲁肽及阿必鲁肽分别干预T2DM大鼠后，其NF-κB mRNA表达水平均有不同程度降低，且以阿必鲁肽组下降更为明显。与上述SOCS-3的变化呈良好同步性。也与Aslam等[13]既往报道相一致。

综上所述，阿必鲁肽可降低T2DM大鼠FBG和血脂水平，尤其降糖效果优于利拉鲁肽，其作用机制可能与阿必鲁肽更能下调下丘脑SOCS-3、NF-κB mRNA的表达有关，下一步将结合多靶点研究阿必鲁肽的治疗作用，进一步丰富临床应用的理论依据。

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本文作者简介：

孙晶波(1978-)女，汉族，主治医师，主要从事糖尿病临床防治工作

参考文献

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