Cx32和p-AKT蛋白在胃癌组织中的表达变化及其临床意义

程玉，薛晶，次云哲

(承德医学院，河北承德067000)

胃癌在所有常见癌症中发病率排名第4，且病死率排名第2[1]，阐明其发生、发展的分子机制并有效指导临床治疗显得尤为急迫。近年来，信号传导异常改变成为胃癌发病机制的研究热点。相邻细胞间进行直接信息交流的惟一通道为细胞间隙连接，间隙连接蛋白32(Cx32)是构成胃黏膜间隙连接通道主要的结构和功能蛋白[2]。磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)能调控许多与细胞代谢、凋亡、增殖和分化有关的蛋白，从而抑制细胞的凋亡，并促进肿瘤细胞的生长[3]。但是，这种细胞间信号传导与细胞内信号通路的相互影响，国内外研究很少。本研究拟通过检测正常胃黏膜与胃癌组织中Cx32与p-AKT的表达差异，探讨二者的相互关系，为阐述胃癌的发生、发展机制提供新思路。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集承德医学院附属医院2012年7月～ 2014年2月收治的胃癌初诊患者60例，男45例、女15例，中位年龄56岁；肿瘤组织高、中分化24例，低分化26例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期28例，Ⅲ～Ⅳ期32例；侵犯浆膜48例，淋巴结转移35例；术前均未行放、化疗。患者均行胃癌切除术，均经术后病理学检查证实为胃腺癌，相应癌旁组织均未见累及，另取30例正常胃黏膜(据癌灶边缘10 cm以上)作为对照。所有标本离体后分为两份，一份离体后立即置于液氮中保存(用于Western blotting检测)，另一份置于10%甲醛溶液中固定(用于免疫组化检测)。

1.2 Cx32与p-AKT检测方法

1.2.1 免疫组化Elivision法 将取材后的标本常规石蜡包埋，脱蜡脱水，连续4 μm切片。严格按照说明书步骤进行实验操作，最后封片观察。同时设立阴性及阳性对照。Cx32与p-AKT阳性染色细胞均呈棕黄色，用IPP图像分析软件分析免疫组化图片。选取图片上阳性染色的区域(AOI)，测定该区域的光密度(OD)值；选取并测量有效统计区域的面积，计算选择区域内的光密度平均值(IOD)，计算同一类型标本切片各照片的平均值及标准差。

1.2.2 Western blotting法 称取适量组织(50～100 mg)并剪碎，加入约600 μL RIPA蛋白裂解液和5 μL PMSF蛋白保护液，BCA法测定蛋白浓度。灌制5%的浓缩胶和12%的分离胶，每泳道加总蛋白量80 μg进行电泳分离；在稳流状态低温下，将蛋白转至聚乙烯二氟(PVDF)膜上。常温封闭3 h，分别加入兔抗人Cx32(Bioword Technology公司)及p-AKT(Abcom公司)单克隆抗体(1∶10 000稀释)和小鼠抗人β-actin单克隆抗体(1∶1 000稀释)，4 ℃孵育过夜。TBST洗膜后加入HRP标记的山羊抗兔二抗(1∶10 000稀释)和HRP标记的山羊抗鼠二抗(1∶3 000稀释)，室温孵育1 h，洗膜、显影、定影。Cx32及p-AKT的相对表达量用Cx32/β-actin和p-AKT/β-actin灰度值表示，灰度采用IPP图像分析软件分析。

2 结果

2.1 免疫组化检测结果

2.1.1 Cx32和p-AKT在正常胃黏膜及胃癌组织中的表达及二者的相关性 Cx32在正常胃黏膜组织中阳性表达蛋白主要定位于细胞膜，而在癌组织中主要表达于细胞质。p-AKT阳性染色主要定位于细胞质。与正常胃黏膜组织比较，胃癌组织中Cx32表达降低、p-AKT表达增高(P均<0.05)，且二者的表达呈负相关(r=-0.297，P<0.05 )。见表1。

表1 胃癌组织与正常胃黏膜组织中Cx32和p-AKT免疫组化检测结果

2.1.2 Cx32和p-AKT表达与胃癌临床病理参数的关系 见表2。

表2 Cx32和p-AKT表达(免疫组化)与胃癌临床病理参数的关系

2.2 Western blotting检测结果

2.2.1 Cx32和 p-AKT在正常胃黏膜及胃癌组织中的表达及二者的相关性 与正常胃黏膜组织比较，胃癌组织中Cx32表达降低、p-AKT表达增高(P均<0.05)，且二者的表达呈负相关(r=-0.431，P<0.05 )。见表3。

表3 胃癌组织与正常胃黏膜组织中Cx32和p-AKT的Western blotting检测结果

2.2.2 Cx32和p-AKT表达与胃癌临床病理参数的关系 见表4。

3 讨论

由间隙连接蛋白β1基因编码的Cx32，大量表达于哺乳动物的胃黏膜上皮；成熟黏膜内的Cx32似乎能形成生物学的关键路径，可增强细胞间电或者是新陈代谢的合作功能[4]。新近有研究[5,6]发现，Cx32参与了宫颈癌细胞的抗凋亡作用及肝癌细胞的上皮-间质转化过程。本研究结果显示，Cx32在正常胃黏膜组织中阳性表达蛋白主要定位于细胞膜，而在癌组织中表达下调，且主要表达于细胞质，细胞膜极少表达，从而间接证实了细胞癌变过程中存在间隙连接通讯功能障碍。本研究还发现，高、中分化胃癌组织中Cx32表达均高于低分化胃癌组织，TNM Ⅰ～Ⅱ期胃癌组织Cx32表达高于Ⅲ～Ⅳ期，有淋巴结转移的胃癌组织中Cx32表达低于无淋巴结转移者。所以我们推测，Cx32可能参与了胃癌的发生，并影响了胃癌的生物学行为。Cx32 表达水平下降和间隙连接细胞间通讯功能异常，可能参与了胃癌恶性程度的进展和肿瘤细胞的侵袭转移。

表4 Cx32和p-AKT表达(Western blotting)与胃癌临床病理参数的关系

AKT信号传导通路能通过促进肿瘤细胞的增殖、抑制细胞凋亡、促进血管形成、增强肿瘤细胞侵袭力等，促进肿瘤演进过程[7]。p-AKT可促进不同肿瘤细胞的浸润和转移能力。例如：p-AKT通过增强基质金属蛋白酶2活性，从而促进小鼠乳腺癌上皮细胞的浸润[8]；鳞状细胞癌中，活化的p-AKT能促进上皮-间质转化[9]。本研究发现，p-AKT在胃癌中的表达明显高于正常胃组织，其表达与胃癌患者的性别、年龄无关，随着胃癌分化程度的降低而增高，随着胃癌TNM分期的增高而增高，且侵犯浆膜及有淋巴结转移者表达增高。这些现象提示，p-AKT在胃癌组织中表达增高，其高表达可能与胃癌发生、发展及浸润、转移有关系。

本研究还发现，胃癌组织Cx32的表达降低而p-AKT表达增高，并且Cx32与p-AKT的表达呈负相关。这种现象可能是通过p-AKT自身磷酸化或者是通过对多种信号传导分子的激活，从而启动Cx32的磷酸化，最终破坏了细胞间隙连接通讯，细胞之间相互控制能力减弱，细胞能够过分地克隆、生长[10]。Zhao等[11]研究发现，Cx32可通过p53及AKT信号通路调控肝癌细胞的转移和增殖。但是，Cx32能否通过AKT信号通路影响胃癌的生物学功能，国内外尚未见报道。

总之，本研究发现Cx32和p-AKT的表达与胃癌的发生、发展相关，二者在胃癌中的表达呈负相关，推测二者在胃癌生物学行为中可能具有相互抑制作用。但是本研究样本量较少，并且只是停留在组织层面。本课题组将进一步进行细胞及动物试验，更深层次地探讨二者在胃癌发生发展过程中的相互关系，为胃癌发病机制的研究提供新思路。

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