芍药苷对银屑病小鼠皮损的治疗作用及机制探讨

李娜，赵颖，张晓杰，李伟宁

(1山东中医药大学，济南250355；2 山东中医药大学附属医院)

银屑病是T细胞介导的慢性炎症疾病，特征是表皮增生、角化过度、炎症细胞浸润以及血管形成增加[1，2]，全球患病率为2%～3%[3]。目前研究发现，血管内皮生长因子(VEGF)家族中以VEGF-A为主，常以其水平表示VEGF水平，其受体主要包括VEGFR1、VEGFR2。研究表明[4～6],银屑病患者血清VEGF水平与疾病严重程度密切相关，VEGF诱导的血管异常生成被认为是银屑病发病机制之一。因此，调控VEGF是治疗银屑病的关键方法之一[7]。然而，由于复杂的病因及化疗的不良反应，目前没有较理想的银屑病药物用于临床。芍药苷(PF)是芍药总葡萄糖苷(TGP)的主要成分，具有抗炎、免疫调节及护肝的功能。多项研究[8,9]指出，PF在银屑病治疗中具有抗炎作用，但其对银屑病发病过程中血管生成增加是否有作用尚不清楚。2016年5月～2017年5月，我们观察了PF对银屑病小鼠的治疗作用，并探讨其是否通过调控银屑病皮肤病变中的VEGF发挥作用。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 40只雌性8～11周龄小鼠，购自上海实验动物中心小鼠，饲养于无病原微生物的环境，均按照动物保护及应用协会的指导说明进行。咪喹莫特(IMQ)霜(四川明欣药业)，纯度96%的PF(宁波立华植物提取技术有限公司)。制冰机(北京长流科学仪器公司)，电热恒温水箱(上海跃进医疗器械公司)；正置显微镜(Olympus公司)，石蜡切片机(Leica公司)；Quanti Fast SYBR Green PCR Kit试剂盒(Qiagen公司)，Light CyclerTM480 Ⅱ型荧光定量PCR仪(Roche公司)，低温冷冻离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司)，旋涡振荡器(青浦泸西仪器厂)，电动匀浆机(Fluko公司)，mini protean 3 cell电泳仪(Bio-Rad 公司)，PS-9电转仪(大连竞迈科技有限公司)；ELISA试剂盒(eBioscience公司)，MK3酶标仪(Finnpipette公司)，Tanon-5200成像系统(Tanon公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组、造模与用药处理 将40只小鼠随机分为4组，每组10只。各组将小鼠背部毛发全部剔光，用Na2S擦拭。A组小鼠背部每天涂抹凡士林，连续涂抹7 d；B、C、D组小鼠均先用IMQ霜擦拭7 d(银屑病造模)，B、C组分别腹腔注射生理盐水、PF 200 mg/(kg·d)10 d，D组腹腔注射PF 200 mg/(kg·d)后6 h背部皮下注射重组VEGF蛋白 100 ng 10 d。 以小鼠背部出现一定范围肉眼可见鳞屑性红斑区域，判为银屑病造模成功。在治疗第18天小鼠被安乐死，收集皮损组织及眼眶静脉血液标本。

1.2.2 皮损组织病理观察 收集皮损组织，以4%多聚甲醛固定后进行石蜡包埋。从石蜡组织块上切取4 μm厚切片，HE染色后光学显微镜下进行组织学分析，并行微血管计数。采用Weidner微血管计数法评价：将切片置于40倍显微镜下确定染色最高血管密度区域，然后置于200倍显微镜下，选择3个最高血管密度区进行微血管计数，求其平均值。

1.2.3 外周血VEGF蛋白检测 采用ELISA法，按照试剂盒说明书进行操作。

1.2.4 皮损组织VEGF、VEGFR1、VEGFR2 mRNA检测 采用实时定量PCR法。利用TRIzol试剂抽提小鼠背部皮肤组织总RNA，以M-MLV反转录酶体系将总RNA(1 μg)反转成cDNA。用于GADPH、VEGF、VEGFR1、VEGFR2基因检测的RT-PCR引物序列，见表1。实时定量PCR反应体系：SYBR Green Mix 12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，ddH2O 9.5 μL，cDNA模板2 μL。PCR反应条件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40个循环；最后72 ℃ 5 min。以GAPDH基因作内参，应用 2-ΔΔCT方法分析相关基因VEGF、VEGFR1、VEGFR2的相对表达量。

表1 VEGF、VEGFR1、VEGFR2及内参基因PCR引物序列 (5′→3′)

2 结果

2.1 各组皮损组织病理观察结果 B、D组皮损组织具有典型的银屑病样病理特征，如表皮角化过度和角化不全，棘层增厚，表皮突下延，真皮乳头内血管增多、扩张；相比之下，A组皮损组织未见病理学异常，C组皮损组织银屑病样病理特征显著减轻。A、B、C、D组皮损组织中血管数分别为(9.33±3.51)、(21.33±3.51)、(11.33±3.05)、(14.67±4.16)条，B组皮损组织中血管数多于A、C、D组(P均<0.05)，D组多于C组但无统计学差异。

2.2 各组外周血VEGF蛋白水平比较 A、B、C、D组外周血VEGF蛋白水平分别为(92.47±18.87)、(232.70±48.38)、(114.52±27.72)、(162.96±30.22)pg/mL，B组外周血VEGF蛋白水平高于A、C、D组(P均<0.05)，D组高于C组但无统计学差异。

2.3 各组皮损组织中VEGF、VEGFR1、VEGFR2 mRNA表达量比较 见表2。

表2 各组皮损组织中VEGF、VEGFR1、VEGFR2 mRNA表达量比较

注：与A组比较，aP<0.05；与B比较，bP<0.05；与C组比较，cP<0.05。

3 讨论

银屑病是最常见的慢性炎症性增生性皮肤病之一，易复发，病情顽固且可造成全身系统损害。其主要的组织病理学改变为新生血管形成，角质形成细胞过度增生及炎症细胞浸润。其中，新生血管形成可能是银屑病发病的关键因素之一。

银屑病在中医文献中有“干癣”“松皮癣”“白疕”等名称。中医学一般认为，银屑病初起多由风寒、风热之邪侵袭，营卫失和，气血不畅，阻于肌表，日久化热而生；有的因脾虚失其运化，湿热蕴积，外不能宣泄，内不能利导，郁阻于肌肤所致；或者风寒、风热、湿热之邪日久化热化燥，气血耗伤则生风化燥，肌肤失养，郁阻肌表而成；也有因享赋不足，肝肾两亏，冲任失调而发病。近年来我们通过大量临床经验的积累，认为该病是身心疾病，越来越重视情志因素在诱发和加重银屑病中的作用。将银屑病从肝论治，在龙胆泻肝汤的基础上配伍平肝柔肝药白芍，调气机而畅情志，对银屑病的恢复有较好的效果。

白芍味苦、酸，入肝经，能补肝血而柔肝。各路医家用以疏肝理气，柔肝养血，缓中止痛，平肝敛阴。其主要药效成分被称为白芍总苷，包括PF、羟基芍药苷、芍药花苷、苯甲酰和芍药内酯苷，其中PF占90%以上。PF是一种单萜类糖苷化合物，具有抗炎、抗过敏以及免疫调节的功效。我们前期研究采用独特的治疗干预模式，造模后实验组小鼠病变皮肤组织出现典型的银屑病皮损特征，如表皮角化过度，角化不全，棘层肥厚，真皮和表皮炎症浸润，真皮乳头内毛细血管增生、迂曲、扩张等，这些指征在PF治疗后得到了明显的缓解；相反，同时予PF和VEGF处理的小鼠银屑病皮损重回造模小鼠水平。表明PF全身给药可有效缓解银屑病造成的皮肤炎症，而PF、VEGF联合给药可消除这种作用[10]。

VEGF又称血管通透因子或血管调理素，最先从肿瘤细胞分离出来，是一种能与肝素结合的二聚体糖蛋白分子，并能特异性地作用于血管内皮细胞，是目前所发现的生物体内最强、最特异的血管活性因子，能促进血管形成、增加血管通透性。VEGF在银屑病皮损和血清中过表达，与银屑病斑块形成、真皮乳头层毛细血管扩张、扭曲密切相关。因此，VEGF在银屑病发病机制中可能起关键作用。VEGF家族有5个成员，分别为VEGF-A、B、C、D、E和胎盘生长因子。人体中最常见的是VEGF-A，其位于染色体6p21.3，全长14 kb，由8个外显子和7个内含子构成，是一种35～45 kb的同型二聚体糖蛋白，由两个亚基通过二硫键相连。其氨基酸序列高度保守，与血小板衍生生长因子(PDGF)及胎盘生长因子之间具有部分同源性。

VEGF有VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3 3种受体,他们都是酪氨酸激酶受体(RTKs)，具有高亲和力[11]。VEGF在银屑病发病机制中的潜在作用与VEGF基因多态性和银屑病患者VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3过表达密切相关[12]。VEGFR1在正常血管发育中起重要作用，负责招募造血前体和引导单核细胞迁移；而VEGFR2则决定血管内皮细胞的迁移和增殖，其最重要的功能是增加血管通透性[13]。本研究结果显示，VEGF、VEGFR1和VEGFR2基因水平在银屑病小鼠的血清和皮损组织中均高表达，并且这种高表达水平在PF治疗后恢复正常。PF、VEGF联合给药逆转了PF对银屑病小鼠的治疗作用，这很好地解释了VEGF在维持表皮屏障功能中的作用，表明角质细胞增生与表皮VEGF之间存在重要联系[14]。一些研究报道指出，实验诱导皮肤炎症小鼠的表皮中VEGF过表达，进而诱导的炎症反应导致出现了银屑病的形态学、组织学和免疫学特征[15]。上述实验结果表明，银屑病发病机制的关键早期特征之一可能是通过上调VEGF及其受体引起表皮和免疫学改变。本研究中，D组皮损组织VEGF、VEGFR1、VEGFR2 mRNA表达量高于C组，差异有统计学意义；虽然D组外周血VEGF蛋白水平高于C组，皮损组织中血管数多于C组，但尚无统计学差异。这可能与本研究观察时间较短，PF与VEGF联合给药已经从基因水平进行了逆转，但外周血及组织学方面尚未产生明显变化有关。

综上所述，PF对银屑病小鼠的皮损具有一定治疗作用，与其抑制VEGF及其受体表达抗血管生成有关。本研究阐明了PF治疗银屑病可能的分子机制，为银屑病的治疗提供了新思路。

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