内窥镜在模拟人结直肠癌散发性癌灶模型构建及监测中的应用

宋丹，郑勇斌，童仕伦，肖旷，杨超，杨玉杰，黄晓东

(武汉大学人民医院，武汉430060)

近年来，随着内窥镜技术的发展，使得结直肠内不典型增生病变实现了早发现、早诊断、早治疗，且因创伤小、操作方便等优势而广泛用于临床[1～3]。同时，科研人员也试图将内窥镜技术应用到小鼠结直肠癌模型构建中，并实时监测肿瘤的发生与发展[4]，如Becker等[5]建立的应用于活体小鼠的结肠镜技术。但不同于人结肠镜，小鼠结肠镜成本较高，且小鼠结直肠癌模型构建相对较困难，均限制了其推广应用[6]。因此，2015年1～12月，我们制备了携带Cre酶的慢病毒，经改造后的硬质内窥镜行APCloxP/loxP基因工程鼠结直肠黏膜下注射，构建模拟人结直肠癌散发性癌灶模型，同时在慢病毒注射后应用纤维支气管镜实时监测肿瘤的生长情况，并与小鼠活体成像及解剖后检测结果对比，以探索其在小鼠结直肠癌模型构建中的有效性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 4周龄健康雄性SPF级C57小鼠雌雄各取15只、4周龄健康雄性APCloxP/loxP基因工程鼠100只，SPF环境12 h昼夜交替，适宜温度、湿度下饲养，小鼠实验前不做禁食禁水处理。

1.1.2 设备与试剂 设备：CO2恒温孵箱(Thermo Fisher公司)，倒置荧光显微镜(Olympus公司)，超净工作台。试剂：DMEM高糖培养基，PBS，胎牛血清(Gibco公司)，胰酶等；CaCl2转染试剂盒(碧云天公司)，慢病毒浓缩纯化试剂盒(Biomiga公司)。质粒：慢病毒载体pHIV-Ubi-Cre-EGFP-SV40-Luc-IRES-Puromycin、包装质粒pMD2.G(addgene12259)与psPAX2(addgene12260)。

1.1.3 内窥镜 包括硬质内窥镜与纤维支气管镜(PENTAX,FB-8V)。硬质镜上绑定2根导管(硬膜外导管替代)，1根导管连接气体加压设备，另1根导管用作微量注射针通道。配套设备包括图像采集系统、气体加压设备及光源。

1.2 人结直肠癌散发性癌灶模型构建

1.2.1 美蓝小鼠结直肠黏膜下注射 4周龄健康雄性SPF级C57小鼠30只，用0.5%戊巴比妥钠麻醉小鼠并将其固定于操作台上；取出硬质内窥镜并打开成像系统、光源及气体加压设备，对固定好的小鼠行扩肛操作。此步骤需细致温柔，可涂抹甘油于扩肛器上以减少损伤。肛门扩张完毕，用适量生理盐水清洁灌肠，以保证操作视野及操作空间；导入硬质内窥镜，使用微量注射器吸取30 μL美蓝溶液，以轻柔而快速的动作将其注射至结直肠黏膜中(图1、2)；避免反复操作，切勿刺破肠壁。注射完毕后，将小鼠放回鼠笼。观察美蓝渗漏情况，以评价该方法的可行性。

注：A:硬质内窥镜；B:纤维支气管镜；C:病毒结直肠黏膜下注射操作；D:纤维支气管镜肠腔内检查操作。

图1小鼠结肠镜系统

图2 小鼠结直肠黏膜下慢病毒注射示意图及肠镜检查情况

1.2.2 慢病毒包装与浓缩纯化 转染前30 min，吸去细胞培养液，加入新鲜不含抗生素的完全培养基。取4 μg待转染质粒，加入到100 μL CaCl2溶液中混匀(按6孔板的1个孔进行说明)。随后将DNA-CaCl2溶液加入到100 μL PBS溶液中混匀，室温孵育15 min后加入到培养板中，用细胞培养箱继续培养。转染后48 h，收集细胞上清液并按照Biomiga慢病毒浓缩纯化试剂盒说明书进行病毒浓缩纯化，收获的病毒保存于-80 ℃冰箱待用。

1.2.3 慢病毒颗粒行小鼠灌肠 随机选取转基因鼠50只(灌肠组)，用0.5%戊巴比妥钠麻醉小鼠，并将其固定于操作台上；按前述方案扩肛后，用1 mL注射器吸取生理盐水清洁灌肠3次；吸取30 μL病毒颗粒(病毒放置于冰上携带至动物房)注入结肠肠腔内，抽出注射器，按压肛门并使小鼠取头低脚高位保持30 min。

1.2.4 慢病毒颗粒经硬质内窥镜行小鼠结直肠黏膜下注射 取剩余的转基因鼠50只(注射组)，麻醉及固定操作同灌肠组；取出硬质内窥镜，打开成像系统、光源及气体加压设备；对小鼠按前述方案扩肛后，用微量注射器吸取30 μL病毒颗粒(病毒放置于冰上携带至动物房)注射至小鼠结直肠黏膜下。

1.3 内窥镜监测肿瘤发生 慢病毒感染后第3周开始，每周利用纤维支气管镜监测成瘤情况。检查前用0.5%戊巴比妥钠麻醉小鼠，并将其固定于操作台上；取出纤维支气管镜，打开成像系统、光源及气体加压设备；按前述方法对小鼠扩肛，石蜡油润滑镜体后细致轻柔导入小鼠结直肠内，观察肠腔内肿瘤发生情况。

1.4 小鼠活体成像监测肿瘤发生 慢病毒感染后第3周开始，每周行小鼠活体成像监测肿瘤发生及转移情况。无菌PBS将D-荧光素钠盐配制成15 mg/mL，0.2 μm滤器过滤除菌后混匀，冰冷避光保存。按10 μL/g体质量浓度腹腔注射相应体积的15 mg/mL D-荧光素钠盐。注射入体内10～20 min(待光信号达到最强稳定平台期)后行成像分析。

1.5 解剖取材检测肿瘤发生及其组织病理学评价 第9周末，所有小鼠行安乐死并解剖探查，记录肿瘤发生发展情况。同时，将盲肠至直肠的消化道取出，仔细剥离肠系膜、脂肪等肠外组织。注射器抽取PBS冲洗净肠道，用4%多聚甲醛冲洗肠道预固定10 min后，以PBS冲洗净多聚甲醛；沿纵轴剪开肠腔，将其铺展开后拍照，记录肿瘤发生的数目、位置及大小。随后行常规石蜡包埋，4 μm切片，常规HE染色，判断肿瘤类型。

1.6 内窥镜的安全性评价 操作过程中，分别记录硬质内窥镜与纤维支气管镜所致结直肠穿孔引起小鼠死亡的情况。

1.7 统计学方法 采用Graphpad Prism 5.0统计软件。两个样本率的比较采用χ2检验，Spearman等级相关分析纤维支气管镜检出结果与解剖后取材检出结果之间的关系。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结直肠癌模型鼠构建情况 30只小鼠采用美蓝行结直肠黏膜下注射实验，23只可见结肠黏膜下隆起，且退针后未见美蓝渗漏，其注射成功率为76.7%。灌肠组灌肠后第3天不明原因死亡2只，剩余48只中7只解剖取材可见肿瘤发生，肿瘤发生率为14%。注射组中3只因结肠穿孔引发脓毒血症死亡,剩余47只中21只解剖取材可见肿瘤发生，肿瘤发生率为42%。灌肠组成瘤率低于注射组，差异有统计学意义(χ2=8.38，P<0.05)。

2.2 结直肠癌模型鼠肿瘤检出情况 100只小鼠中，解剖取材探查发现成瘤小鼠28只、瘤块34个，纤维支气管镜检出成瘤小鼠21只、瘤块26个(76.5%)，其中肿块直径<2 mm以及距离肛门超过2 cm的肿块检出率较低(表1、2)。纤维支气管镜检出肿瘤的位置(距肛外缘距离)、大小与解剖检测结果相关(r分别为0.99、0.97，P均<0.05)。小鼠活体成像检出28只阳性，检出率为100%。

表1 不同大小肿瘤纤维支气管镜检出情况

表2 不同位置肿瘤纤维支气管镜检出情况

2.3 内窥镜安全性情况 注射组经硬质内窥镜行结直肠黏膜下注射过程中，发生结肠穿孔3只，均因腹腔感染及全身脓毒血症死亡。纤维支气管镜检查过程中，两组未发生结直肠穿孔。

2.4 组织病理学结果 所有肿块进行常规HE染色，发现肿块均为腺瘤。

3 讨论

目前，结肠镜检查不仅是结直肠疾病诊断的金标准，同时可根据病情及时行镜下微创治疗，因此广泛用于临床[7，8]。但是，小鼠结肠镜在小鼠结直肠癌模型构建中的应用仍不理想，一方面由于模型构建难度高，另一方面由于小鼠结肠镜的技术要求高、成本及维修费用高，限制了它的推广与使用[9～12]。据此，本研究试图结合使用硬质内窥镜与纤维支气管镜，探索其在小鼠结直肠癌模型构建中的应用。

截至目前，为了构建模拟人结直肠癌散发性癌灶，有研究通过将CDX2P 9.5-NLS Cre小鼠胚胎与APCloxP/loxP小鼠胚胎共移植到C57BL/6J假孕小鼠子宫中，实现结肠部位APC基因的突变，以构建原发性结直肠癌[13]；或者使用表达Cre酶的慢病毒或腺病毒对转基因鼠灌肠，使其感染结直肠黏膜下干细胞并敲除APC基因，使干细胞突变诱发结直肠癌的发生[14，15]。然而，此类研究仍无法精确控制肿瘤的生长位置与数量，模型鼠之间同质性较低。若能将慢病毒颗粒局部注射到结直肠黏膜下，使其感染1个或多个结肠隐窝内干细胞，实现特定部位基因的敲除，便可更高效构建出模拟人的散发性癌灶。据此，我们在硬质内窥镜基础上进行部分改造后以替代小鼠结肠镜，建立了内窥镜下小鼠结直肠黏膜下慢病毒注射的方法。同时采用前期繁育的APCloxP/loxP小鼠，将携带Cre酶的慢病毒颗粒注射入该小鼠结直肠黏膜下，使其感染隐窝功能干细胞并修饰APC基因，从而诱发干细胞突变，构建模拟人结直肠癌散发性癌灶。

实验前期，本研究应用硬质内窥镜行小鼠结直肠黏膜下美蓝注射训练，其注射成功率均维持在70%以上；随后，在进行慢病毒黏膜下注射的实验中，其成瘤率为42%，相较于慢病毒灌肠组(成瘤率为14%)，其成功率明显提高。由于慢病毒感染后第3周开始即可检测到被感染部位报告基因的表达，且肿瘤一般发生在第3～9周。因此，本研究于第3周开始采用纤维支气管镜定期监测肿瘤的发生与发展，并记录肿块大小与位置。第9周末将95只小鼠行安乐死并解剖取材，病理检查表明28只小鼠共形成34个瘤块，其中前期纤维支气管镜检出26个瘤块，检出率76.5%，当肿块体积<2 mm或位置越过结肠脾曲时均较难检出。另外，分析发现纤维支气管镜检出肿瘤的位置、大小与解剖后检查结果相关。尽管纤维支气管镜无法避免出现一定的漏检情况，但仍能很好地实时监测肿瘤的发生与发展，可用小鼠活体成像法弥补，从而实现对小鼠结直肠癌发生、发展、转移的全程监视，并可提示在合适时机进行取材。

在内窥镜下注射慢病毒时，约4%小鼠出现结肠穿孔。为避免此种情况的发生，在注射过程中应细致轻柔，避免反复注射，选择微量注射器，注射针头使用石蜡油润滑等。另外，维持稳定的气压在注射过程中具有重要作用，一方面可以扩大操作视野，另一方面可以展平肠内壁，从而更有利于肠黏膜下注射。行慢病毒注射前，不必禁食禁水，以免造成小鼠内环境紊乱，其结肠内容物可通过按摩小鼠腹部使其排除或使用生理盐水灌洗。因肠壁内压力较高，病毒注射时应缓慢推注，以免病毒溶液溢出。注射后半小时内应使小鼠维持在麻醉状态，避免因小鼠活动造成注射部位病毒溶液溢出。 对于明显成瘤者，在行内窥镜检查的同时，利用活检钳取材并活检，可及时监测到肿块发生的性质。虽然，内窥镜的检出率较低，但可反复在体取材进行标本研究。而活体成像不仅可监测肿瘤的发生，还可以监测肿瘤转移。因此，在转移灶发生前，通过内窥镜检查原发灶的局部特性，待小鼠活体成像确定转移灶形成后，对小鼠行安乐死取材检查转移灶性质，两者结合可更好地研究结直肠癌的局部免疫状态及其他特性。

综上所述，本研究探索了内窥镜在造模以及肿瘤发生发展中的监测作用，尽管无法保证每只小鼠100%的成功率，但因其突出的优势，仍具有广阔的应用前景。

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