CHB患者PegIFN治疗前差异表达microRNAs的检测及意义

杨艳琳 刘明 邓樱 郭艳 张绪清 向德栋 蒋黎 游忠岚 伍艺 李茂仕 毛青

400038 重庆，陆军军医大学(第三军医大学)西南医院全军感染病研究所感染病研究重庆市重点实验室

乙型病毒性肝炎(hepatitis B virus, HBV)呈世界性流行，据估计全球HBsAg携带者有2.4亿人，每年有近1百万人死于HBV相关性疾病[1-2]。早期获得HBsAg清除可降低患者发生肝硬化、肝癌的风险[3]。但是，临床上HBsAg清除率很低，干扰素和核苷(酸)类似物(nucleos(t)ide analogue, NAs)治疗的HBsAg清除率分别为3%～7%/年、0%～3%/年[1]。研究发现干扰素治疗时通过优化CHB患者的基线特征可提高HBsAg清除率，如OSST研究和NEW SWITCH研究发现NAs经治的CHB患者基线HBsAg <1500 IU/ml时序贯接受PegIFN治疗后HBsAg清除率分别为22.2%、28.5%[4-5]。因此研究HBsAg清除的影响因素对于改进CHB治疗具有重要意义。MicroRNA(miRNA)作为生物体内源性基因表达调控分子(19～23nt)，等研究报道，其可参与HBV治疗的免疫应答、影响病毒复制如miR-199 a-3p和miR-210分别靶向HBsAg和pre-S1编码区从而降低HBsAg的表达水平[6]。由于细胞中miRNA表达水平相对于血浆、血清较稳定和肝组织标本难以获取等原因，不容易受其他因素的影响，故本研究选择外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)中的差异miRNAs作为研究对象。

1 对象与方法

1.1研究对象从2015年4月30日开始从重庆西南医院门诊招募符合入组要求的病例，随访观察PegIFN应答结局。研究对象入组标准为：①年龄18～65岁；②HBsAg阳性至少6个月，基线HBsAg水平 < 1500 IU/ml，HBeAg(-)，HBV DNA < 1000IU/ml；③ALT ≤ 2ULN(正常值上限，我们医院为42IU/ml)；④干扰素初治，核苷(酸)经治或者未治疗。排除标准：①合并感染HAV、HCV、HDV、HEV、HIV；②有酒精性肝病、非酒精性脂肪肝、药物性肝炎、自身免疫性肝病等其他慢性肝病的证据；③近6个月内接受免疫调节药物治疗；④有生育计划。所有患者入组前均签署知情同意书，该研究已通过西南医院伦理委员会批准，并在中国临床试验注册中心注册(注册号ChiCTR-ROC-16008735)。

1.2治疗方案招募的患者接受PegIFNα-2 a治疗(180 μg/w)，疗程至少48周，单药或者联合NAs治疗，最终疗程及药物剂量由门诊医师根据患者具体病情决定，但不超过96周。若干扰素治疗后HBsAg无明显下降甚至上升，可提前终止治疗，停药后每3个月进行复查随访。

1.3实验室检测方法

1.3.1 临床指标检测：乙肝标志物用Abbott公司配套试剂盒进行检测，HBsAg检测范围为0.05 IU/ml～> 250 IU/ml，HBsAg < 0.05 IU/ml认为是HBsAg清除。血清HBV DNA运用上海复星长征医学科学有限公司的试剂盒进行检测，HBV DNA检测下限为<500 IU/ml；全自动生化仪(7600-020，HITACHI公司)测定血清ALT、TBIL、ALB水平；全自动五分类血液分析仪(XT-2000i，Sysmex公司)测定WBC、PLT。

1.3.2 总RNA提取：外周静脉血PBMC用淋巴细胞分离液(LymphoprepTM)分离，胎牛血清重悬(HyCloneTM, Cat.N:SV30087.03)储存在液氮中备用。PBMC的总RNA根据Qiagen试剂盒说明书提取(Cat No/ID: 217004)，RNA的浓度及质量用Nano Drop 2 000 C分光光度计进行检测并进行凝胶电泳。

1.3.3 miRNAs芯片检测:芯片检测委托上海康成生物公司完成，芯片根据miRCURYTMHy3TM/Hy5TMPower labeling(Exiqon, Vedbaek, Denmark, Cat#208032-A)和miRCURYTM LNA Array(v.19.0)(Exiqon)试剂盒说明书进行标记和杂交。图像扫描导入GenePix Pro 6.0(Axon)软件进行数据提取，根据以下标准筛选两组间差异表达的miRNAs：差异倍数>1.5,P< 0.05。

1.3.4 miRNAs的实时荧光定量:根据miRNA在两组间的表达差异程度，选择差异倍数 > 3,P< 0.05的前7条miRNAs进行实时荧光PCR定量验证，其中3条上调，4条下调。实验过程按照microRNA通用定量试剂盒说明书进行(Cat#GMRS-001,吉玛基因,上海)。荧光定量上游引物序列见表1，差异miRNAs的表达水平用ΔCT方法表示(ΔCT=CT目标miRNA - CT内参U6)。

1.3.5 差异miRNAs的靶向基因预测:使用TargetScan 7.1和miRDB V5.0在线数据库预测差异表达的miRNAs靶基因，对预测到的所有靶基因根据以下原则进行排序筛选：TargetScan 7.1数据库靶基因cumulativeWeightedContext++Score ≤-0.3，miRDB V5.0数据库靶基因targetScore ≥ 70。并对预测到的靶向基因进行生物信息学分析，即Pathway分析，预测其与HBsAg清除潜在的联系。

表 1 miRNAs引物序列

Tab.1Primers sequence of miRNAs

表2 研究队列的基线特征

Tab.2Baseline characteristic of study cohort

基线特征筛选队列(n=20)验证队列(n=47)清除组未清除组P清除组未清除组P例数1010—1730—男，例数(%)9(90)7(70)058215(88)24(80)0692a年龄，岁29±89464±6800001∗∗∗39±77387±930921既往用NAs史——————是67110220305否43—78—HBVDNA，IU/ml——————低于检测于下限(<500)79058216230228500～100031—17—b基线HBsAg，IU/ml18609(2931⁃72435)18428(6275⁃53669)111654(3336⁃19526)50436(15635⁃87549)001<500，No．(%)770549＄1415009＄500～1000，No．(%)23—210—1000～1500，No．(%)10—15—a基线ALT，IU/ml364±17833069±9903883151±1403721±30650474

$a`=(2*a)/[k*(k-1)+1]=0.014,k=3,a=0.05; i*P< 0.05,**P< 0.01,***P< 0.001

a数据用均值±标准差表示;b数据用中位数表示(四分位间距)；ALT谷丙转氨酶；既往用药史，表示干扰素治疗前是否用核苷(酸)类似物治疗，NAs包括所有常规抗病毒药物：替诺福韦酯，恩替卡韦，拉米夫定，替比夫定，阿德福韦酯等，可以单药或者联合用药，平均用药时间是64.60周 (33.3-82.97)(中位数-四分位间距)

$a`=(2*a)/[k*(k-1)+1]=0.014,k=3,a=0.05;*P< 0.05,**P< 0.01,***P< 0.001;

Notes.adata are presented as mean±SD;bdata are presented as median (IQR range); ALT denotes alanine aminotransferase; WBC, white blood count; History of NAs means whether they have used nucleos(t)ide analogs (NAs) before PegIFN treatment, the NAs include all kinds of conventional medicines: TDF, ETV, LAM, LdT, ADV. They were used by means of monotherapy or combined treatment. The median duration time of NAs was 64.60 w (33.3-82.97) (median±IQR)

1.4统计学方法所有统计分析运用SPSS 23.0软件进行分析。两组之间的差异比较用卡方检验或者Fisher精确概率检验方法，独立样本t检验，曼-惠特尼U检验。双侧检验P< 0.05表示两组间差异有统计学意义。

2 结果

2.1基线特征本研究病例数共67例，分成两个队列：筛选队列(n=20例)和验证队列(n=47例)。停药时HBsAg水平低于0.05 IU/ml认为是HBsAg清除，在表面抗原清除组中，有21例获得HBsAg血清学转换，各基线参数在两队列中差异均无统计学意义，如性别、基线HBV DNA、ALT，但在筛选队列中年龄差异具有统计学意义，基线特征详见表2。

2.2芯片结果筛选队列中10例HBsAg清除与10例未清除患者PBMC抽提的总RNA与miRNA芯片杂交后，获得差异miRNAs芯片图像。结果显示两组间存在明显miRNAs差异表达(差异倍数 > 1.5，P< 0.05)：共417条miRNAs差异表达，其中在清除组上调的有342条，如miR-196b-3p, miR-548ah-5p, miR-5583, miR-122；下调的有75条，如miR-3960, miR-126-3p, miR-146 a, miR-199 a。

2.3差异miRNAs的验证对选择的7条差异显著的miRNAs在验证队列中进行实时荧光定量验证，验证队列由17例HBsAg清除和30例HBsAg未清除病例组成。结果显示有4条miRNAs(miR-3960, miR-126-3p, miR-23 a-3p, miR-335-5p)在验证队列中有统计学差异(P< 0.05)，四条均在HBsAg清除组下调，其余3条miR-196b-3p, miR-548ah-5p, miR-5583差异无统计学意义(P> 0.05)，各条差异miRNAs相对表达水平见图1。

图1 差异miRNAs的相对表达水平，相对表达水平用ΔCT法表示：ΔCT=CT目标miRNA-CT 内参U6Fig.1 The relative expression levels of the differential miRNAs between the two groups. The relative level is shown as ΔCT (ΔCT=CT of interest miRNA-CT of internal control U6)

2.4差异miRNAs靶基因预测对miR-3960, miR-126-3p, miR-23 a-3p和miR-335-5p通过在线数据库TargetScan 7.1和miRDB V5.0预测靶基因，并取两数据库重复出现的部分，筛选出可能与HBsAg清除免疫应答相关的靶基因。结果显示miRNAs的可能靶基因与免疫调节等生物过程相关，如CCL-7、IGSF8、CASP7等。

2.5差异miRNAs靶基因功能预测对差异miRNAs的靶基因进行通路分析，探究其可能参与的生物过程，其中4条差异microRNAs的靶向基因相关的信号通路包括AMPK信号通路、NOD样受体信号通路、NF-kappa B信号通路、mTOR通路等。

3 讨论

本研究通过前瞻性建立PegIFN治疗队列，获得不同应答组之间差异表达的miRNAs，为了排除病毒、宿主免疫因素对HBsAg清除的影响，本研究选择肝功能正常、低基线HBsAg和低病毒载量的CHB患者。研究发现CHB的不同感染阶段具有不同的miRNA表达模式[7]，这可能与他们不同的免疫状态相关。我们推测经PegIFN治疗后获得HBsAg清除的患者，可能在治疗前已经处于一种有利于免疫清除的状态，经PegIFN的免疫调节推动作用后进一步发生HBsAg清除，而用药前差异表达的miRNAs可能与这种免疫状态相关。在验证出的4条miRNAs中，miR-3960被报道可与长非编码RNA HOTAIRMI竞争性结合调节单核细胞/树突状细胞(dendritic cell，DC)的分化[8]，DC作为专性抗原提呈细胞在抗原加工、处理、呈递过程中具有重要作用，是连接固有免疫和适应性免疫的纽带。4条差异miRNAs靶基因的通路分析结果显示与多个重要信号通路相关，如AMPK信号通路、NOD样信号通路、NF-kappa B信号通路、mTOR通路等。AMPK是生物能量代谢调节的关键分子，通过调节组织器官的能量代谢进而影响机体功能，研究发现AMPK信号可影响T细胞的激活和细胞因子的产生[9]，而NF-kappa B被报道在肿瘤早期发展的免疫监视过程中具有重要作用[10]。另外miR-126-3p[11], miR-23 a-3p[12]和miR-335-5p[13]均被报道与肿瘤的侵袭和转移相关，而免疫系统对于肿瘤的监视发挥重要作用，免疫系统的失调可能导致肿瘤的侵袭和转移。综合相关文献报道及差异miRNAs靶基因、信号通路的分析，我们推测miRNAs可能通过调控免疫相关基因的表达，增强HBV清除相关的免疫应答，促进HBsAg清除。

miRNAs除了调控免疫因素外，也可能通过直接抑制HBV DNA的复制或者靶向HBsAg转录本降低HBsAg水平。例如miR-199 a-3p，miR-122，miR-146 a在芯片结果中差异表达，研究报道miR-199 a-3p与HBsAg编码区特定位点结合降低HBsAg的表达水平[7]；miR-122作为肝细胞特异表达的miRNA,可抑制HBV DNA的复制[14]，而miR-146 a通过下调肝细胞内STAT1损伤IFN诱导的免疫应答能力[15]。本研究选择的7条miRNAs中，miR-548ah-5p, miR-196b-3p和miR-5583在验证队列中未验证出差异，可能是该基因本身表达量低以致芯片检测结果容易出现假阳性，或者是验证样本量较少的结果。

综上所述，miRNA对HBsAg清除具有一定的研究价值，miRNA可能通过调节免疫相关基因的表达、直接抑制HBV DNA复制或者HBsAg转录本的翻译获得HBsAg清除。本研究尚存在不足之处：整个研究队列的样本数较少，需要进一步扩大样本进行验证；另外缺乏对差异miRNAs的靶基因的具体分子机制的研究，这将是我们今后的研究方向。

利益冲突:无

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