狂犬病病毒抗体胶体金检测试剂实际效能评价

吕书玉 赵方红 张苗苗 刘宏乾

030002 太原，山西医科大学临床医学二系(吕书玉)；050091 石家庄，河北华安生物医药股份有限公司(赵方红，张苗苗，刘宏乾)

狂犬病(rabies)是由狂犬病病毒(rabies virus)引起的以中枢神经系统感染症状为主的传染性疾病，病死率几乎100%。人感染狂犬病病毒主要是由于被狂犬病病毒感染的动物，主要是犬、猫，咬伤或抓伤导致的。对于狂犬病暴露后处置(post-exposure prophylaxis, PEP)接种狂犬病疫苗必不可少。人体接种狂犬病疫苗后，机体可以产生狂犬病病毒中和抗体，狂犬病病毒中和抗体水平 ≥ 0.50 IU/ml 即可认为达到保护性抗体水平[1]。

检测狂犬病病毒中和抗体水平的金标准是世界卫生组织推荐的小鼠脑内中和试验(mouse neutralizing test, MNT)和快速荧光灶抑制试验(rapid fluorescent focus inhibition test, RFFIT)[1]。MNT和RFFIT技术和操作难度较高，难以普及[2]。国内外目前主要应用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)进行狂犬病病毒IgG抗体筛查[2-4]，应用胶体金(colloidal gold, CG)试剂进行狂犬病病毒IgG抗体筛查的报道资料极少。本研究探索CG试剂在狂犬病病毒IgG抗体筛查中的真实效能，为CG试剂的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1检测样品效价100 IU/ml的人狂犬病免疫球蛋白参考品由河北华安生物医药股份有限公司提供，以ddH2O制备1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45、1∶50、1∶55、1∶100、1∶200、1∶300、1∶400、1∶500系列稀释品。含100份狂犬病疫苗免疫者血清的血清盘由河北华安生物医药股份有限公司利用制备狂犬病免疫球蛋白的备用血浆制备并提供。

1.2主要试剂人狂犬病病毒抗体(IgG)检测试剂盒(胶体金法)由国内某公司生产。细胞培养液(dulbecco′s modified eagle medium, DMEM)、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)为美国Life Technologies公司产品。异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)标记抗狂犬病病毒核蛋白单克隆抗体FDI FUJIREBIO FITC Anti-Rabies Monoclonal Globulin为日本Fujirebio公司产品。

1.3狂犬病病毒抗体检测

1.3.1 CG法:从密封袋中取出检测卡，放在水平工作台面上平置并做好样本标记，取10 μl血清(狂犬免疫球蛋白稀释品)直接加入到加样孔中，再加入100 μl(约2～3滴)样本稀释液，15～20 min内判读结果，20 min后检测结果无效。C线和T线同时出现条带判定为阳性结果，C线出现而T线不出现条带判定为阴性结果，C线不出现条带判定为无效检测。每份样品平行检测2个CG试剂条，测定结果一致判断为有效。

1.3.2 RFFIT法:按照文献[5]中RFFIT操作方法进行，抗体效价 < 0.50 IU/ml判定为阴性结果，抗体效价 ≥ 0.50 IU/ml判定为阳性结果。每份血清平行检测3次，取抗体效价几何平均值(geometric mean titer, GMT)作为最终测定结果。

1.4统计学方法采用Excel表格整理数据，采用SPSS16.0统计学软件进行统计学分析，CG法和RFFIT法检出率的比较采用四格表卡方检验。

2 结果

2.1狂犬病免疫球蛋白系列稀释品RFFIT、CG法比较以“稀释度(RFFIT测定值，CG法检测结果—阳性“+”、阴性“-”)”来表示不同稀释度狂犬病免疫球蛋白稀释品对应的RFFIT检测值(IU/ml)和CG法检测结果，依次为1∶5(19.62, +)、1∶10(9.53, +)、1∶15(6.53, -)、1∶20(5.21, -)、1∶25(3.68, -)、1∶30(3.02, -)、1∶35(3.00, -)、1∶40(2.36, -)、1∶45(2.12, -)、1∶50(1.86, -)、1∶55(1.66, -)、1∶100(0.96, -)、1∶200(0.52, -)、1∶300(0.30, -)、1∶400(0.22, -)、1∶500(0.16, -)。RFFIT测定值9.53 IU/ml(对应1∶10稀释度)以下的各稀释品在CG法中均测定为阴性结果。

2.2狂犬病疫苗免疫者血清RFFIT、CG法比较采用RFFIT和CG法对100份狂犬病疫苗免疫者血清进行检测，RFFIT测定值 < 0.5 IU/ml的血清样品26份，0.50 IU/ml ≤ RFFIT测定值 < 1.00 IU/ml的血清样品18份，1.00 IU/ml ≤ RFFIT测定值 < 2.00 IU/ml的血清样品24份，RFFIT测定值 ≥ 2.00 IU/ml的血清样品32份。RFFIT测定值 < 2.00 IU/ml的血清样品在CG法检测中全部为阴性。RFFIT检测值 ≥ 2.00 IU/ml的血清样品在CG法检测中有4份为阴性，这4份血清RFFIT测定值最高的为 2.80 IU/ml，其余血清样品RFFIT测定值均 ≥ 3.30 IU/ml。

以RFFIT检测结果为标准，CG法的特异性为100.00%(26/26)，假阳性率为0(0/26)；CG法的灵敏性为37.84%(28/74)，假阴性率为62.16%(46/74)。RFFIT阳性检出率为74.00%(74/100)，CG法阳性检出率为28%(28/100)，二者之间差异具有统计学意义(χ2=13.66,P=0.000)。见表1。

表1 快速荧光灶抑制试验和胶体金法检测狂犬病病毒抗体结果比较Tab.1 Comparision of the results of rabies virus antibodies tested by rapid fluorescent focus inhibition test and colloidal gold method

3 讨论

我国是全球第二大狂犬病流行国家，每年PEP消耗人用狂犬病疫苗1 000～1 500万人份[6]。检测狂犬病疫苗接种者血清内狂犬病病毒抗体可以评价PEP的有效性，在某些情况下具有一定的现实意义[7]。CG法只能定性检测狂犬病病毒抗体，操作便捷、不依赖实验室，适合进行狂犬病病毒抗体初步筛查使用[4]。本研究显示CG法对阳性血清有漏检，对阴性血清无漏检，也就是只有假阴性而没有假阳性结果，出现假阴性结果的血清狂犬病病毒中和抗体效价不超过2.80 IU/ml。儿童、老年人、艾滋病患者等免疫力低下人群容易出现接种狂犬病疫苗后血清狂犬病病毒中和抗体水平较低的情况，对于此类人群要谨慎解读CG法筛查时出现的阴性结果[8]。

本研究设立系列狂犬病免疫球蛋白稀释品界定CG法检测狂犬病病毒抗体的下限，即检测灵敏性，结果显示CG法检测下限高于6.53 IU/ml 而低于9.53 IU/ml。然而，CG法检测血清时显示的检测下限高于2.80 IU/ml但是低于3.30 IU/ml，这与狂犬病免疫球蛋白稀释品界定CG法检测下限差距明显，这说明血清中除外狂犬病病毒中和抗体的某些其他成分对CG法检测有未知影响，还有待深入研究其原因。同时，CG法检测并未出现假阳性结果，说明血清中除外狂犬病病毒中和抗体的其他成分可能不会导致CG法检测出现假阳性结果，值得后续增加样品量作进一步研究。

ELISA法检测血清狂犬病病毒抗体时假阳性和假阴性结果并存，通过改进包被抗原质量等手段可以提高ELISA法检测狂犬病病毒抗体的效能，降低假阳性率和假阴性率[9-11]。影响狂犬病病毒抗体CG法试剂检测灵敏性的主要因素是包被抗原的质量，改进包被抗原可以提高其检测灵敏性，同时应注意是否会出现检测假阳性的问题。我国《狂犬病暴露预防处置工作规范(2009年版)》明确MNT、RFFIT是个体进行狂犬病疫苗免疫后抗体检测的标准方法[12]。应用CG法进行狂犬病病毒抗体筛查应当严格把握适用情况和科学解读结果，必要时使用标准方法进行复核，这点应当给予足够重视。

利益冲突:无

参考文献

[1] Manning SE, Rupprecht CE, Fishbein D, et al. Human rabies prevention-United States, 2008: recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices[J]. MMWR Recomm Rep, 2008, 57(RR-3):1-28.

[2] 程满荣, 徐葛林, 吴杰, 等. RFFIT和MNT检测狂犬病毒中和抗体的比较研究[J]. 中国人兽共患病学报, 2009, 25(1): 30-33.DOI: 10.3969/j.issn.1002-2694.2009.01.008.

[3] 王洪飚, 王余俊. 人狂犬病毒IgG抗体定量测定试剂盒(酶联免疫法)的评价[J]. 国际检验医学杂志, 2009, 11: 1142-1142.DOI: 10.3760/cma.j.issn.1673-4130.2009.11.057.

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[5] 吕新军, 王伟伟, 李云云, 等. 采用快速荧光灶抑制试验对一种狂犬病病毒抗体竞争性ELISA检测法的评价[J]. 国际检验医学杂志, 2011, 32 (6): 640-641.

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[8] 谢锦荣, 陈祖华, 黄燕萍, 等. 5423例人用狂犬病疫苗接种后血清学抗体分析[J]. 中华流行病学杂志, 2011, 32(1): 90-91.DOI: 10.3760/ema.j.issn.0254-6450.201 1.01.021.

[9] 王伟伟, 王远征, 张国强, 等. 狂犬病病毒抗体竞争ELISA检测方法的建立及初步应用[J]. 中国生物制品学杂志, 2011, 24 (11):1355-1359.DOI: 10.13200/j.cjb.2011.11.112. wangww. 025.

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[11] Welch RJ, Anderson BL, Litwin CM. An evaluation of two commercially available ELISAs and one in-house reference laboratory ELISA for the determination of human anti-rabies virus antibodies[J]. J Med Microbiol, 2009, 58(Pt 6): 806-810. DOI: 10.1099/jmm.0. 006064-0.

[12] 卫生部. 狂犬病暴露预防处置工作规范(2009年版)[S]. http://www.moh.gov.cn/ mohbgt/ s10695/200912/45090.shtml