高效液相色谱法测定植物油中黄曲霉毒素B1含量的不确定度评定

◎ 乌吉木

（巴彦淖尔市食品药品检验所，内蒙古 巴彦淖尔 015000）

1 概述

1.1 测量依据

GB 5009.22-2016《食品安全国家标准 食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定》。

1.2 测量环境

温度：20 ℃；相对湿度：37%RH。

1.3 测量设备及试剂

安捷伦1260附荧光检测器，C18，填料直径5μm，内径4.6 mm，柱长250 mm，柱后衍生：用AURAINDUSTRIES instrumentation for science碘衍生柱；电子分析天平0～200 g 0.01 g Ⅲ级；黄曲霉毒素免疫亲和层析柱：VICAM Made in the U.S.A； 甲 醇（CH3OH）： 色 谱 纯Honeywell；黄曲霉毒素B1标准品：国家粮食局科学研究院（质量浓度1.96 μg/mL，不确定度0.09 μg/mL）。

1.4 测量对象

植物油。

1.5 测量方法

准确称取试样5.0 g于50 mL离心管中，加入1.0 g氯化钠及加入甲醇-水（7+3）至25 mL（V1）摇匀提取2 min，定量滤纸过滤，准确移取10.0 mL（V2）滤液并加入10.0 mL（V3）水稀释，用定量滤纸过滤一次，备用。临用时摇匀。

净化：将免疫亲和柱连接于20.0 mL一次性注射器下。准确移取10.0mL（V4）样品提取液注入一次性注射器内，接注射器上方手推注射器让液体以约6 mL/min流速缓慢通过免疫亲和柱，直至2～3 mL空气通过柱体。以10 mL水淋洗柱子两次，弃去全部流出液，并使2～3 mL空气通过柱体。准确加入1.0 mL（V）色谱级进口甲醇洗脱，流速为1～2 mL/min，收齐全部洗脱液于玻璃试管中，在50 ℃下用氮气缓缓地将洗脱液吹至近干，用流动相定容至2.0 mL，旋涡30 s溶解残留物，经滤膜（0.22 μm）过滤后进高效液相色谱仪，具体见表2，然后由公式计算出黄曲霉毒素B1的含量。

2 数学模型

式中，C为样液中黄曲霉毒素B1的浓度（μg/L）；m为样品质量（g）；V为最终甲醇洗脱液体积（mL）；w为最终净化洗脱液所含试样质量（g）；V1为样品和提取液总体积（mL）；V2为稀释用样品滤液体积（mL）；V3为稀释液体积（mL）；V4为通过亲和柱的样品提取液体积（mL）；X为样品中黄曲霉毒素B1的含量（μg/kg）。

3 标准不确定度评定

3.1 A类不确定度的计算

实验操作人员技术水平，仪器设备的性能均会影响结果的重复性，以重复条件下标准偏差量化。该不确定度属A类评定，对同一样品进行10次重复测定，实验结果见表1。

表1 黄曲霉毒素B1的测定重复性表

3.2 B类不确定度的计算

3.2.1 样品称量引起的不确定度

TD2002A型电子天平准确称取试样5.0 g（精确到0.01 g），检定证书给出最大允许误差0.05 g（0≤m≤500 g）。由天平引入的不确定度可按B类评定，属均匀分布，样品称量引入的相对不确定度：

3.2.2 标准溶液引起的不确定度

（1）本方法采用的黄曲霉毒素B1标准溶液浓度为1.96 μg/mL，不确定度0.09 μg/mL，k=2为B类评定u标1=0.09/2=0.045。

（2）该标准溶液经2次稀释配成标准工作液，即准确移取1.3 mL黄曲霉毒素B1标准溶液于25 mL容量瓶中，用甲醇水定容至刻度并充分混匀得到标准储备液，准确移取1.0 mL标准储备液于10 mL容量瓶中用甲醇水定容至刻度并充分混匀得到标准使用液。

第1次稀释，定容引起的不确定度：依据JJG196-2006《常用玻璃量器检定规程》2.0 mL移液管A级允许误差±0.012 mL，按B类评定，正态分布，99%概率计相对不确定度：

25 mL容量瓶的体积容量允许误差±0.03 mL，相对不确定度：

3.2.3 曲线拟合产生的相对标准不确定度

本实验共选取5个标准浓度，每个标准点重复测定3次，不同浓度标准溶液的峰面积测定结果见表1。

由表2的数据拟合得到线性方程：A=1.764 01C，斜率k=1.764 01，相关系数r=0.999 656，标准曲线偏差数据计算结果见表3。

表2 不同浓度黄曲霉毒素B1标准溶液的测定结果表

表3 标准曲线偏差数据计算结果表

3.2.4 标准溶液配制过程量器校准产生的相对标准不确定度

标准溶液配制工程中使用了表4中一系列的玻璃量具，均有相应的最大允差按矩形分布考虑由此计算出相对应标准不确定度分量见表4。

表4 标准溶液配制过程中量具校准引起的相对标准不确定度表

由表4合成：

最后配制标准工作液的相对不确定度如下：

3.2.5 检测方法引起的不确定度

该方法依据GB5009.22-2016测定过程包括样品的提取、净化、淋洗、浓缩、定容等过程中都会引入误差，但在实际使实验过程中样品的提取、过滤、免疫亲和柱净化等操作引入的不确定度是难以量化的，结合实际工作可以引入回收率。

本方法中加标回收率分别为89.52%，90.08%，83.60%，83.44%，87.44%，85.08%，83.08%，85.48%，平均值为85.965%，标准偏差为：

样品回收率的不确定度u回=S回

3.3 不确定度的合成

依据不确定度合成公式，该植物油样品中黄曲霉毒素B1的不确定度分量值见表5。

表5 植物油样品中黄曲霉毒素B1含量的测量不确定度分量值表

各相对标准不确定度分量合成：

取置信概率P=95%，k=2，则扩展确定度为：

植物油中黄曲霉毒素B1测量结果为：

3.4 环境温度引起的不确定度

实验室环境温度的变化会引起试剂体积的变化，导致实验误差增大。本实验室内环境温度用空调控制室温在20 ℃，变化较小，由温度变化引起的不确定度本文没有参与评定。

4 结论

采用高效液相色谱法测定植物油样品中黄曲霉毒素B1含量时，影响测量不确定度的主要因素为电子天平示值误差、移液管和容量瓶等使用引起的容量允差、标准溶液的配制、方法的回收率、温度变化、仪器设备引入的测量重复性误差，通过分析表5中不确定度分量得到，影响黄曲霉毒素B1含量的最主要因素是测量重复性、方法的提取回收率、标准溶液的配制。