抑制黄曲霉菌的乳酸菌的分离及鉴定

尹 雪，郭雪峰,2，帕提古丽·毛拉红，刘俊峰,2，张秀萍,2，席琳乔,2

(1 塔里木大学 动物科学学院，新疆 阿拉尔 843300；2 新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室，新疆 阿拉尔843300)

真菌是一类生命力极强的腐败微生物[1]，关于由酵母菌和霉菌污染所导致的饲料损失已有大量报道。目前已经确定有超过200种霉菌在特定食品、动物饲料中生长时会产生对人和动物有害的物质，主要有黄曲霉毒素类、串珠镰刀菌素、赫曲霉毒素类、棒曲霉素、单端孢霉烯类和玉米赤霉烯酮6大类[2]。由于这些毒素具有致癌致畸性，对神经、肝肾也有毒害作用，因此这些腐败真菌在造成巨大经济损失的同时，也对公众的健康构成了极大威胁。如发生在20世纪60年代英国鸡场的“火鸡X病”，几个月内10多万只雏火鸡相继死亡，结果1963年由Spensley证实这种病由黄曲霉菌产生的黄曲霉毒素B1(AflatoxinB1)引起[3]。国内外对抑制黄曲霉毒素进行了大量研究，例如物理方法，包括干燥、冷冻干燥、热处理、红外线处理、微波辐射、气调储藏等，或添加化学防腐剂如乳酸、乙酸、山梨酸、苯甲酸、丙酸等[4-5]。但是这些传统方法都存在一定的弊端，如物理方法会造成营养成分的损失，化学防腐剂则会对人和动物的健康及环境带来危害，而且随着化学防腐剂的大量应用，有研究发现一些真菌已经对其产生了抗性，一些酵母甚至可以利用苯甲酸、山梨酸和丙酸这些常用的防腐剂，部分青霉属的菌株可以在山梨酸钾存在条件下生长，而一些霉菌具有降解山梨酸酯的能力[6]。现有研究表明，微生态制剂具有最小的不良反应和最佳的适口性等特点，已成为替代抗生素的主要添加剂；乳酸菌作为微生物来源的添加剂，被公认为是目前最传统、最安全的添加剂，已被广泛用于医药、食品和饲料等领域[7]。本研究从新疆传统发面面肥中分离筛选出能够抑制黄曲霉菌生长的乳酸菌，旨在对其生理生化特性及分类地位进行深入研究，进而为改善青贮饲料发酵品质及抑制黄曲霉菌生长提供乳酸菌资源。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 样品与菌种 样品来源：2016年7月从新疆阿克苏地区随机采集发面面肥、发霉花生、发霉玉米及变质青贮饲料样品。将样品封存于密封袋中，贴上标签标明采样时间和地点后运回实验室，于4 ℃条件下，由塔里木大学畜牧科技重点实验室草食家畜营养研究室保存备用。

菌种来源：从发面面肥样品中分离获得乳酸菌，从发霉花生、玉米及变质青贮饲料中分离获得黄曲霉菌，由塔里木大学畜牧科技重点实验室草食家畜营养研究室保存备用。

1.1.2 主要试剂和仪器 主要试剂：细菌提取试剂盒、质粒小提试剂盒、T4连接盒和通用型DNA纯化回收试剂盒，均购自天根深化科技有限公司；引物FA-27F:5′-GCAGAGTTCTCGGAGTCACGAAGAG-TTTGATCCTGGCTCAG-3′，RA-1495R:5′-AGCG-GATCACTTCACACAGGACTACGGGTACCTT-GTTACGA-3′，均购自北京英俊生物技术公司。

主要仪器：超净工作台(SW-CJ-2FD，上海博迅实业有限公司)，电子天平(XP603S，瑞士梅特勒-托利多中国公司)，高压灭菌锅(SX-500，上海法润科学仪器有限公司)，电热恒温培养箱(DNP9162，上海精宏实验设备有限公司)，紫外可见光分光光度计(T6，北京普析通用仪器有限责任公司)，PCR仪(Eppendorf，德国)，离心机(Eppendorf，德国)，旋涡混合器(HMS-350，金坛市科析仪器有限公司)，电泳仪(JY-300C，北京君意东方电泳设备有限公司)，凝胶成像仪(GEL DOC XR，北京赛百奥科技有限公司)，pH计(PHSJ-5，上海仪电科学仪器有限公司)，超低温冰箱(海尔集团公司)。

1.1.3 培养基 MRS固体培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母粉5 g，葡萄糖20 g，柠檬酸二铵2 g，硫酸镁0.05 g，磷酸氢二钾2 g，乙酸钠5 g，吐温-80 1 g，硫酸锰0.05 g，碳酸钙1 g，琼脂15 g，溶于1 L去离子水，121 ℃灭菌20 min。参考凌代文[8]《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》中所描述的配方配制。

马铃薯葡萄糖(PDA)固体培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂8 g，溶于1 L去离子水，121 ℃灭菌20 min。参考张国华[9]所描述的配方配制。

曲霉菌琼脂(AFPA)固体培养基：酵母粉20 g，蛋白胨10 g，柠檬酸铁铵0.5 g，0.2%二氯硝基苯胺1 mL，氯霉素0.1 g，琼脂15 g，溶于1 L去离子水，121 ℃灭菌15 min。参考李院[10]所描述的配方配制。

1.2 方 法

1.2.1 发面面肥中乳酸菌的分离与纯化 根据《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》[8]、《常见细菌系统鉴定手册》[11]和《乳酸细菌：基础、技术和应用》[12]所描述的乳酸菌菌株形态进行乳酸菌菌株的分离鉴定。无菌操作称取10 g发面面肥样品放入90 mL无菌蛋白胨水中，密封，置于摇床上以120 r/min摇动2 h，吸取1 mL上清液加入到9 mL无菌蛋白胨水中，漩涡振荡，依次稀释成10-5，10-6，10-7，10-84个梯度，分别取4个梯度的菌液100 μL涂布于固体 MRS平板培养基表面，30 ℃培养48～72 h。通过观察菌落颜色、大小、光泽、是否有透明圈等挑取单菌落，在MRS固体培养基上划线，30 ℃恒温培养48～72 h，重复划线分离培养3次，得到纯化的单菌株[13-14]。用MRS液体培养基富集(30 ℃培养24 h)，与等体积的甘油混合，封装，―70 ℃保存备用。

1.2.2 发霉花生、 玉米及变质青贮饲料中黄曲霉菌的分离与纯化 使用曲霉菌琼脂(AFPA)固体培养基对发霉花生、玉米及变质青贮饲料稀释液进行分离。无菌操作称取各样品10 g放入90 mL无菌蒸馏水中，按1.2.1节方法稀释成10-2，10-3，10-4，10-54个梯度的菌悬液，分别取4个梯度的菌悬液100 μL涂布于AFPA固体培养基表面，置于霉菌恒温培养箱中，28 ℃培养4～7 d，挑取少许霉菌所产孢子到曲霉素琼脂(AFPA)固体培养基上进行划线分离、纯化。纯化的霉菌单菌落生长4～7 d后，用接种环挑取少量带孢子的菌丝，用乳酸石碳酸棉兰染色，对霉菌的菌体和菌丝进行显微镜形态观察[15]。挑选AFPA培养基背面呈亮橙色、霉菌孢子呈淡黄色的霉菌孢子进行保存备用。

1.2.3 霉菌孢子液的制备 将保存备用的黄曲霉菌菌株接种在PDA斜面培养基表面，28 ℃恒温培养3～5 d至大量孢子产生，加入5 mL灭菌生理盐水于斜面试管，涡旋振荡5 min，用无菌纱布过滤去除营养菌丝体[16]。采用血球计数板测定孢子浓度，将孢子浓度调整为105个/mL，备用。

1.2.4 筛选抑制黄曲霉菌活性的乳酸菌 采用双层平板法[10]筛选对黄曲霉菌具有抑制作用的乳酸菌。先将MRS固体培养基倒入培养皿中作为下层平板，待其凝固后，用接种环沾取生长至对数期的乳酸菌菌液在平板上划2条2～3 cm的平行直线，于37 ℃培养24～36 h至长出菌苔。然后将含有孢子浓度为105个/mL的PDA半固体培养基倒入培养皿中，覆盖在含有乳酸菌菌苔的下层培养基上，于28 ℃培养48～72 h，检测乳酸菌生长条带周围是否出现抑菌圈，挑选有抑菌效果的乳酸菌进行后期试验。同时，本试验还将具有抑菌作用的乳酸菌菌液以1%接种量，按1∶1比例两两组合后进行抑菌试验。

1.2.5 乳酸菌的生理生化鉴定 乳酸菌的生理生化鉴定包括：产气试验、耐酸耐盐试验、温度生长试验，以及D-葡萄糖、D-麦芽糖、乳糖、D-甘露糖、D-半乳糖、L-山梨糖、D-松二糖、D-松三糖、纤维二糖、木糖醇、D-棉籽糖、D-甘露醇、D-果糖、蔗糖、L-鼠李糖、D-木糖、D-山梨醇、D-蜜二糖等碳水化合物碳源发酵试验[17]。

1.2.6 乳酸菌DNA的提取与鉴定 对具有抑制黄曲霉菌作用的乳酸菌菌液提取基因组DNA[18]。以乳酸菌菌株基因组DNA为模板，利用细菌通用引物FA-27F和RA-1495R，对细菌的16S rDNA进行PCR扩增。PCR扩增程序：95 ℃ 预变性3 min；94 ℃变性1 min，53 ℃ 退火1 min，72 ℃延伸90 s，30个循环；72 ℃延伸8 min。用1.0%琼脂糖凝胶对扩增的PCR产物进行电泳检测。回收PCR产物，连接pMD-18T载体并转化E.coliDH5α，经蓝白斑筛选，将阳性克隆送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

1.2.7 同源性分析与系统发育树的构建 采用核酸Blast技术，将所测序列信息与NCBI网站的GenBank数据库进行对比，获得与所测序列同源性最高的已知分类地位的菌种。然后从GenBank数据库中获得已知菌株的16S rDNA基因序列，与所测菌株的16S rDNA序列一起，采用Clustal进行比对，绘制系统发育树，确定各菌株的分类地位[19]。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌的分离与纯化

试验所筛选的12株乳酸菌菌株单菌落均为圆形，其中菌株F3菌落表面凹凸不平，淡黄色，边缘不整齐，质地黏稠且半透明；菌株F1、F2、F4、F6、F7、F8、F9菌落均为灰白色，边缘整齐，质地粗糙，无光泽且不透明；菌株F5、F10、F11、F12菌落均为白色，边缘整齐，质地黏稠，有光泽且不透明。所有菌株革兰氏染色均为阳性，且接触酶反应均为阴性；菌株F1、F2、F4、F5、F7、F9、F11、F12均是球菌，F3细胞形态呈短杆状，F6、F8、F10细胞形态呈长杆状。

2.2 黄曲霉菌的分离与纯化

试验发现，在发霉花生、玉米及变质青贮饲料10-3稀释菌悬液对应的平板上，均长出了培养基背面呈亮橙色且具有黄曲霉菌特征的菌落，进一步对其进行菌落特征观察，结果如图1所示。由图1可知，黄曲霉菌菌落呈放射状，孢子呈淡黄色，在AFPA培养基上生长，培养基背面呈亮橙色。本试验从发霉花生、玉米及变质青贮饲料中分离出4株菌落形态基本一致的黄曲霉菌。

A.黄曲霉菌在AFPA培养基上的单菌落形态；B.黄曲霉菌在AFPA培养基上的背面照(亮橙色)A.Single colony morphology of Aspergillus flavus on AFPA medium;B.The back photos of Aspergillus flavus on the AFPA medium (Bright orange)图1 黄曲霉菌的菌落形态Fig.1 Colony of Aspergillus flavus

2.3 筛选具有抑制黄曲霉活性的乳酸菌

在对黄曲霉菌具有抑制活性的乳酸菌筛选试验中发现，F3、F11和F12 3株乳酸菌对黄曲霉菌有抑制作用(图2和表1)。由表1可以看出，与单乳酸菌菌株相比，将具有抑菌作用的3株乳酸菌菌液两两混合后其抑菌效果显著提高，其中F3与F11组合的抑菌效果最好，抑菌区直径可达到5.3 cm(图2-A)，单个菌株中F11的抑菌效果显著高于其他单个菌株(P<0.05)，抑菌区直径达到4.5 cm(图2-B)。

A.菌株F3与F11菌液混合后对黄曲霉菌的抑制效果；B.菌株F11对黄曲霉菌的抑制效果A.Inhibition effect of hybrid F3 and F11 strains of lactic acid bacteria on Aspergillus flavus;B.Inhibition effect of F11 strain of lactic acid bacteria on Aspergillus flavus图2 乳酸菌对黄曲霉菌的抑制作用 Fig.2 Inhibition of lactic acid bacteria on Aspergillus flavus

乳酸菌Lacticacidbacteria抑菌区直径/cmInhibitionzonediameterF32.3±0.14eF114.5±0.46bcF121.8±0.10fF3+F115.3±0.18abF3+F125.0±0.12bF11+F123.0±0.10dF3+F11+F126.2±0.24a

注：同列数据后标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

Note:Different lowercases mean significant difference (P<0.05).

2.4 具有抑菌活性乳酸菌的鉴定

2.4.1 生理生化鉴定 对具有抑菌活性的3株乳酸菌的生理生化指标及碳源利用方式进行鉴定，结果如表2和表3所示。由表2可以看出， 3株乳酸菌发酵葡萄糖均不能产气，为同型发酵乳酸菌； 3株乳酸菌均能在5 ℃条件下弱生长，在10 ℃条件下除菌株F11生长良好，其余2株菌生长较弱，在40和45 ℃，3株乳酸菌均能良好生长；NaCl为3%和6.5%时3株菌均能良好生长;在pH=3时3株乳酸菌均不能生长,在pH=4时3株乳酸菌均能弱生长，pH值为5～7时3株乳酸菌均能良好生长。由表3可知：3株乳酸菌均可利用D-葡萄糖、D-麦芽糖、D-甘露糖、纤维二糖、D-甘露醇、D-果糖、蔗糖、D-山梨醇；F3菌株不能利用酵乳糖、D-半乳糖、L-山梨糖、D-松三糖、木糖醇、D-棉籽糖、L-鼠李糖、D-木糖、D-蜜二糖；F11菌株不能利用酵L-山梨糖、D-松二糖、木糖醇、D-棉籽糖、L-鼠李糖；F12菌株不能利用L-山梨糖、木糖醇、D-棉籽糖、L-鼠李糖、D-木糖。

表2 3株乳酸菌生理生化指标的测定结果Table 2 Physiological and biochemical indexes of lactic acid bacteria

注：“+”表示可以生长，“-”表示不生长，“W”表示弱生长。下同。

Note:“+”Growth,“-”No growth,“W”Weak growth.The same below.

表3 乳酸菌碳源发酵试验结果Table 3 Carbon source test of lactic acid bacteria

2.4.2 16S rDNA序列同源性分析 对具有黄曲霉菌抑制活性的乳酸菌菌株16S rDNA测序后进行同源性分析，构建系统发育树，以确定菌株的分类，结果见图3。由图3可以看出，菌株F3与类芽孢杆菌(Paenibacillussp.)MD9B2的同源性为100%，菌株F11与屎肠球菌(Enterococcusfaecium)V9-156的同源性为100%，菌株F12与乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)25F1的同源性为100%。依据16S rDNA基因序列的同源性分析，确定菌株F3为类芽孢杆菌，菌株F11为屎肠球菌，菌株F12为乳酸乳球菌。

图3 菌株F3、F11和F12的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of strains F3, F11 and F12

3 讨 论

本研究所用发面面肥样品是从新疆阿克苏地区随机采样获得，共筛选出12株乳酸菌菌株，其中球菌8株，杆菌4株，说明球菌是发面面肥中的优势菌群。本试验所分离的优势乳酸菌与其他研究者的结果略有不同。张国华[9]对我国5个不同地区发酵酸面团中的优势菌群进行研究发现，除安徽地区的优势菌为明串珠菌(Leueonostoe)外，河南、山西、甘肃及黑龙江等地区均以乳杆菌(Lactobacillus)为优势菌。王雪婷等[20]选取河南周口和山西运城的传统酸面团进行分离鉴定，结果显示其优势菌群为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)和面包乳杆菌(Lactobacilluscrustorum)。这可能是由于各地区发面面肥的制作工艺和水土环境具有一定的差异，因而导致细菌组成差别较大。黄曲霉(Aspergillusflavus)主要存在于霉变的谷物、花生、种子及动物饲料中[21]。本研究利用AFPA培养基结合菌落形态，从发霉花生、玉米和变质青贮饲料中分离筛选出4株黄曲霉菌，这与雷明霞[22]的研究结果基本一致。

本研究利用从新疆发面面肥中分离出的12株乳酸菌进行黄曲霉菌抑菌试验，筛选出F3、F11和F12 3株对黄曲霉菌具有抑制作用的乳酸菌,经16S rDNA序列分析发现，3株乳酸菌分别为类芽孢杆菌(F3)、屎肠球菌(F11)和乳酸乳球菌(F12)。绕胜其等[23]从酸菜、火腿、香辛料等原料中筛选出9株对黄曲霉菌具有较强抑制作用的产芽胞杆菌，这与本试验所分离类芽孢杆菌的抑菌效果基本一致。相比较而言，目前研究者对于乳杆菌抑菌作用的研究较为深入。Elnezami等[24]研究发现，LactobacillusrhamnosusLGG和LC-705对黄曲霉毒素B1(AFB1)有较强的吸附作用，这2株菌分别使AFB1下降54%和44%。Adel Hamidi等[25]研究发现，Lactobacilluspentosus和Lactobacillusbeveris2株乳酸菌能够很好地抑制黄曲霉菌的生长。本研究分离出对黄曲霉菌具有抑菌作用的3株乳酸菌，其抑菌有效物质还有待进一步研究，才能使其能更好地应用于优质青贮饲料的制作。

4 结 论

本研究从采自新疆阿克苏地区的发面面肥样品中分离出12株乳酸菌，通过黄曲霉菌抑菌试验筛选出3株对黄曲霉菌具有抑制作用的乳酸菌菌株。将具有抑菌作用的F3、F11和F12 3株乳酸菌菌液以1∶1比例两两组合后其抑菌效果显著提高，其中将3株菌混合后抑菌效果最显著。经鉴定3株乳酸菌分别为类芽孢杆菌(Paenibacillussp.)(F3)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)(F11)和乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)(F12)。

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