羽毛降解杆状链霉菌S-28遗传转化系统的建立与优化

张晋龙，马怡茗，舒伟学，李晓霞，柯 欣，颜 华，贾良辉

(西北农林科技大学 生命科学学院，陕西 杨凌 712100)

现代农业的发展促进了家禽养殖业的规模化生产，伴随而来的是家禽养殖场和屠宰场每年产生数千万吨的羽毛废弃物。羽毛废弃物的传统处理方法主要为填埋、焚烧，这不仅造成资源的巨大浪费，而且严重污染环境。禽类羽毛中蛋白含量极高，一般为75%～90%，而且氨基酸种类齐全，是具有较高营养价值的饲料蛋白资源。但由于禽类羽毛主要成分是角蛋白，性质极其稳定且含有丰富的二硫键，如未经处理，消化道常见酶类(胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等)很难将其降解[1-2]。近些年，利用微生物降解角蛋白废弃物引起了人们的广泛关注，是资源化利用羽毛废弃物的重要手段[3]。目前在细菌、真菌和放线菌中均已经发现了可以降解角蛋白的菌株，其中以芽胞杆菌属的细菌居多[4]。由于放线菌可以产生丰富的次级代谢产物，同时由于其生活史中营养菌丝的生长特点，使其更有利于侵入羽毛硬质角蛋白从而使角蛋白降解，所以羽毛降解放线菌的研究受到了越来越多的重视。

菌株S-28是由西北农林科技大学微生物资源研究室分离的1株能够高效降解羽毛的链霉菌，根据菌株的形态、生理生化特性及16S rDNA序列分析，确定其为杆状链霉菌(Streptomycesbacillaris)的一个菌株;除高效降解羽毛外，菌株S-28还对多种植物病原真菌有强烈的抑制效果；全基因组测序也表明，S-28含有丰富的次级代谢产物生物合成基因簇(未发表数据)，具有较好的研究价值。目前，关于杆状链霉菌(Streptomycesbacillaris)的研究很少，且主要集中在其发酵条件优化及活性物质的分离方面。Hu等[5]从StreptomycesbacillarisSNB-019的发酵液中发现了新肽L-O-Lac-L-Val-D-O-Hiv-D-Val，该肽有抑制自噬作用，具有治疗肿瘤疾病的潜能。Jeng等[6]从20年普洱茶饼中分离鉴定了StreptomycesbacillarisR9菌株，发现其可以显著提高茶叶中多酚含量，减少DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)自由基。但关于杆状链霉菌遗传转化系统的研究尚未见报道。本研究尝试通过接合转移的方式将外源基因导入到杆状链霉菌(Streptomycesbacillaris) S-28，并对影响接合效率的培养基的种类、MgCl2浓度、热激温度、预萌发时间、供受体比例和接合转移时间等要素进行优化，为今后该菌株的遗传改造奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 菌株与质粒 羽毛降解杆状链霉菌S-28菌株由西北农林科技大学微生物资源研究室分离保存；大肠杆菌(Escherichiacoli)S17-1为供体菌株；pSET152质粒为大肠杆菌-链霉菌穿梭整合型质粒，具有安普霉素抗性基因aac(3)IV及噬菌体φC31整合酶基因int的整合位点attp[7]。

1.1.2 培养基 大肠杆菌液体培养基为LB，链霉菌液体培养基为TSB[8]。链霉菌产孢培养基及接合转移培养基均为MS，孢子预萌发培养基为2×YT，具体配方参见链霉菌遗传操作手册[9]。

1.1.3 试 剂 抗生素红霉素(Ery)、卡那霉素(Kan)、安普霉素(Apr)和潮霉素(Hyg)，其他生化试剂萘啶酮酸(Nal)，均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 质粒及链霉菌基因组提取

大肠杆菌质粒提取基本操作参见文献[10]。链霉菌总DNA的提取参照链霉菌遗传操作手册[9]。

1.3 S-28菌株抗生素耐受性检测

选取安普霉素、卡那霉素、红霉素、潮霉素4种抗生素，分别加入MS培养基中，每种抗生素终质量浓度分别为0，5.0，10.0，20.0，50.0 μg/mL。划线接种野生型S-28，28 ℃黑暗培养6 d后观察结果。

1.4 大肠杆菌和杆状链霉菌S-28的接合转移

将整合型质粒pSET152用热激法转入大肠杆菌(Escherichiacoli)S17-1中，得到供体菌株S17-1/pSET152。挑取单菌落，接种于5 mL含有安普霉素50 μg/mL的LB液体培养基中，37 ℃培养过夜后，按1∶100的体积比转接到50 mL含有相同抗生素的新鲜LB液体培养基中，37 ℃培养至OD600为0.4～0.6时离心收集菌体，用等体积不含抗生素的新鲜LB培养基洗涤菌体3次，将菌体悬浮于500 μL不含抗生素的LB培养基中。

在长满杆状链霉菌S-28孢子的MS平板上，用接种环刮下孢子后接到含有玻璃珠的玻璃瓶中，手动或摇床振荡30 min，用脱脂棉过滤收集S-28孢子，然后将孢子悬浮于500 μL的2×YT培养基中，热激10 min后于37 ℃、150 r/min摇床中预萌发2.5 h。

将备用的大肠杆菌和预萌发好的链霉菌S-28孢子悬液按1∶1体积比混合，吸取100 μL涂布于接合培养基表面，28 ℃培养16～20 h后，用一定质量浓度Apr(≥10 μg/mL)和Nal(≥25 μg/mL)覆盖，28 ℃培养3～4 d后长出接合子。

1.5 接合转化子的PCR扩增反应验证

刮取S-28接合转化子的孢子接种到含有10 μg/mL安普霉素的TSB液体培养基中培养48 h，收集菌丝体，提取其总DNA作为模板。以野生型链霉菌S-28的总DNA为阴性对照，以pSET152质粒为阳性对照。根据安普霉素抗性基因设计1对引物(AprF:5′-CTTCGCATCCCGCCTCTGG-3′和AprR:5′-CAATACGAATGGCGAAAAG-3′)，扩增片段大小为750 bp。PCR反应条件为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，30个循环；72 ℃10 min。

1.6 接合转移体系的优化

孢子生长培养基选择高氏1号、2CMY、ISP4、GSY、YMS和MS 6种；接合转移培养基中MgCl2浓度分别设置为0，10，20，30，40，50 mmol/L；热激温度设置为25，40，45，50，55 ℃；预萌发时间设置为0，2，4，6，8 h；供受体比例设置为1∶1，10∶1，100∶1，1 000∶1；接合转移时间设置为12，14，16，18，20，22，24 h；筛选转化子的抗性培养基选择MS(含Apr 10 μg/mL和Nal 25 μg/mL)。除供受体比例优化试验中所需供体大肠杆菌数量从107～1010以10倍递增外，其他试验中链霉菌S-28菌丝体量或孢子量保持107，供体大肠杆菌细胞数量保持107，最后以肉眼可分辨的转化子为准。接合转移效率=接合子数/孢子量，取3次重复的平均值。

1.7 接合转移体系复合最优条件验证

将上述试验过程中获得的各个优化条件，包括培养基的种类、MgCl2浓度、热激温度、预萌发时间、供受体比例和接合转移时间，进行复合最优条件遗传转化体系试验验证，以肉眼可分辨的转化子为准，接合转移效率=接合子数/孢子量，取3次重复的平均值。

2 结果与分析

2.1 杆状链霉菌S-28的抗生素耐受性

为了建立一个有效的接合转移系统，必须首先测定S-28菌株的抗生素耐受性。本研究分别测试了S-28菌株对红霉素(Ery)、卡那霉素(Kan)、安普霉素(Apr)和潮霉素(Hyg) 4种抗生素的耐受水平，结果如表1所示。由表1可知，S-28对Apr和Kan比较敏感，在含Apr 10.0 μg/mL或Kan 20.0 μg/mL的平板上生长极慢；在含Apr质量浓度≥20 μg/mL或含Kan ≥50 μg/mL的培养基平板上，S-28不生长。S-28菌株对Ery和Hyg不敏感，在50.0 μg/mL Ery或Hyg的平板上生长依然旺盛，因此选择安普霉素(Apr≥10 μg/mL)或卡那霉素(Kan≥20 μg/mL)作为遗传操作的选择标记。

表1 羽毛降解杆状链霉菌S-28的抗生素耐受性测定结果Table 1 Antibiotic tolerance of the feather-degrading strain Streptomyces bacillaris S-28

注：+++．正常生长；++．生长缓慢；+．生长极慢；-．不生长。

Note：+++．Normal growth；++．Slow growth；+．Extremely slow growth；-．No growth．

2.2 杆状链霉菌S-28接合转化子的PCR鉴定及稳定性检测

pSET152属于穿梭-整合型质粒，转入到链霉菌S-28后，不会单独存在于细胞质中，而是整合到该菌株的基因组上[7]。随机挑选7个链霉菌S-28接合子，提取其基因组DNA，用安普霉素的抗性基因引物分别进行PCR扩增。PCR检测结果(图1)显示，接合转化子及阳性对照pSET152质粒均扩增出750 bp左右的条带，而野生型链霉菌S-28 DNA未扩增出目的片段，由此证实pSET152质粒已成功转入到链霉菌S-28中。

为了验证S-28遗传转化系统的稳定性，将经PCR鉴定的7个接合转化子在MS培养基(含Apr 10 μg/mL和Nal 25 μg/mL)上传5代后，在TSB培养基(含Apr 10 μg/mL)中摇菌培养，提取DNA进行PCR验证，结果与第1代接合子的验证结果一致，表明pSET152在链霉菌S-28中能够稳定遗传。

M1．质粒pSET152；M2．野生型S-28；M3．DNA Marker;1～7．链霉菌S-28接合转化子M1．Plasmid pSET152;M2．Wild type S-28;M3．DNA Marker;1-7．Exconjugants of Streptomyces bacillaris S-28图1 链霉菌S-28/pSET152阳性接合子的PCR验证Fig.1 PCR validation of positive exconjugants ofS-28/pSET152

2.3 杆状链霉菌S-28遗传转化系统的优化

2.3.1 产孢培养基的选择 作为接合转移的受体，链霉菌孢子的质量直接决定接合转移是否能够成功。为了获得足量的新鲜孢子，将链霉菌S-28接种到多种链霉菌常用的产孢培养基中，28 ℃恒温培养6～8 d，观察菌丝的生长及产孢状况，结果表明，该菌在培养3～5 d后开始长出白色的气生菌丝；培养4～8 d开始产微黄色孢子，同时伴随有棕色色素产生。由表2可知，链霉菌S-28在MS培养基上生长旺盛。收集孢子稀释计数，计算每种培养基上所产生的孢子数量，发现最佳产孢培养基为MS，因此选择MS为接合转移最适产孢培养基。

表2 链霉菌S-28在不同培养基上的生长状况Table 2 Morphological observation of S-28 cultivated indifferent media

2.3.2 培养基中MgCl2浓度对接合转移效率的影响 有研究表明，MgCl2能够提高接合转移效率[9,11]，但是不同的链霉菌所需的MgCl2最适浓度不同。在本研究中，以MS为基础培养基，分别添加0，10，20，30，40，50 mmol/L MgCl2，结果见图2。如图2所示，接合转移效率随着MgCl2浓度的增加先升高后降低，且MgCl2浓度为10 mmol/L时，接合转移效率最高；MgCl2浓度继续升高，接合转移效率逐渐降低。因此在后续的优化条件试验中，均以含有10 mmol/L MgCl2的MS培养基为接合转移培养基，以不含MgCl2的MS培养基为筛选转化子的培养基。

图2 MS培养基中MgCl2浓度对接合转移效率的影响Fig.2 Effect of MgCl2 concentration on conjugation efficiency

2.3.3 热激温度对接合转移效率的影响 热激处理被认为是供体与受体混合均匀前的预处理[12-13]。为了探究热激温度对接合转移效率的影响，设置25，40，45，50，55 ℃ 5个温度梯度各处理10 min，结果如表3所示。由表3可知，接合转移效率随着热激温度的增加先升高后降低，且热激温度为40 ℃时接合转移效率最高，达到(4.32±0.31)×10-5，之后随着热激温度的升高接合转移效率逐渐降低，因此S-28孢子40 ℃热激10 min时接合转移效率最高。

表3 热激温度对S-28孢子活性和接合转移效率的影响Table 3 Effect of heat treatment of S-28 spores on spore viability and conjugation efficiency

2.3.4 热激孢子预萌发时间对接合转移效率的影响 在S17-1/pSET152与S-28接合转移之前，热激孢子预萌发时间也是影响接合转移效率的参数，因此在S-28孢子40 ℃热激10 min后对预萌发时间也进行了优化，结果如图3所示。由图3可知，预萌发时间越长，接合转移效率越低。故确定40 ℃热激10 min且不进行预萌发处理时进行接合转移。

图3 热激孢子预萌发时间对接合转移效率的影响Fig.3 Effect of incubation time of heat-treated spores onconjugation efficiency

2.3.5 供受体比例对接合转移效率的影响 供受体比例在链霉菌接合转移过程中是一个很重要的参数。在本试验中，以S-28孢子数量为107保持不变，然后与数量为107～1010的S-17/pSET152供体按比例混合，检测接合转移效率,结果见表4。从表4可以看出，当供体菌的数量为107，能获得相对较少的接合子，当供体菌的数量为108，接合转移效率最高,达到(5.63±0.31)×10-5，比供体菌为107时提高了10倍，而随着供体菌数量的增加，接合转移效率又随之降低。说明当供受体比例为10∶1时，S17-1/pSET152和S-28接合转移效率最高。

表4 供受体比例对接合转移效率的影响Table 4 Effect of donor-to-recipient on conjugation efficiency

2.3.6 接合转移时间对接合转移效率的影响 供体到受体的接合需要一定的时间，供受体混匀涂布到接合转移培养基MS，经过一定的时间后覆盖抗生素筛选接合子。如果接合时间过短，接合转移不能完成，导致接合转移效率较低，但如果接合转移时间过长，会出现过多的假阳性。如图4所示，供体到受体接合12～20 h时，都可以获得较多的接合子，其中12～16 h时差异不是很明显，18～20 h时接合转移效率最高；接合22～24 h时链霉菌S-28生长过于旺盛，导致阳性接合子难以挑选。因此选择18～20 h为筛选接合子的最佳时期。

2.3.7 综合最优条件对接合转移效率的影响 综合最优接合转移单因素条件进行链霉菌S-28和E.coliS17-1/pSET152接合转移试验验证，发现接合转移效率达到10-4。

图4 接合转移时间对接合转移效率的影响Fig.4 Effect of exconjugation time on conjugation efficiency

3 讨论与结论

链霉菌是一类高G+C含量的革兰氏阳性菌，能产生丰富的次级代谢产物，目前发现的12 000余种天然抗生素中约60%由链霉菌产生[14-15]，许多已在人类医药、农业和畜牧业中体现出重要的应用价值。杆状链霉菌S-28除可以高效降解羽毛外，还含有丰富的次级代谢产物生物合成基因簇，有一定的研究价值。建立可靠且高效的遗传转化体系是开展后续工作的必要前提。

链霉菌是一个高度分化的菌属，不同菌种之间有很大差异，适用于一种链霉菌的转化方法不一定适用于其他链霉菌[9,16-17]。链霉菌常见的遗传操作方法有电转化、原生质体转化和接合转移3种[18]。在建立S-28遗传转化系统的过程中，也尝试过电转化和原生质体转化，但未获得成功。本研究在S-28菌株抗生素耐受性测试、产孢培养基和供体菌株选择的基础上，通过接合转移的方法，成功建立了S-28的遗传转化系统。

本研究结果表明，培养基中随着MgCl2浓度的增高，接合转移效率先升高后降低，当接合转移培养基MS中MgCl2浓度为10 mmol/L时，接合转移效率是不含MgCl2的7～8倍，说明一定浓度的MgCl2可以提高接合转移效率。研究表明Mg2+与膜结构及功能的完整性有关，在培养基中加入一定量的Mg2+能够提高接合转移的效率[19]。热激温度对接合转移效率也有显著影响，随着热激温度的升高，接合转移效率先升高后降低，在热激温度40 ℃时接合转移效率最高，当热激温度达到55 ℃并处理10 min后，接合转移效率最低。有研究表明，适度的高温热激处理可降低细胞内限制酶活性，使得接合转移效率变高[20-21]；而55 ℃的热激处理使得部分孢子丧失活性，从而降低了接合转移效率。本研究发现，供受体比例对接合转移效率也有影响，供受体比例不同，接合转移效率也不同，且供受体比例为10∶1时接合转移效率最高。有研究表明，天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)[13]和结节链霉菌(Streptomycesnodosus)[22]供受体比例不会影响接合转移效率，但北里孢刚毛菌(Kitasatosporasetae)[23]、林可链霉菌(Streptomyceslincolnensis)[24-25]和淀粉酶产色链霉菌(Streptomycesdiastatochromogenes1628)[26]却受供受体比例的影响。

综合各种因素，本研究建立并优化了S-28的遗传转化系统：以MS为接合转移最适培养基，MgCl2浓度为10 mmol/L，孢子在40 ℃热激10 min且不进行预萌发处理，供受体比例为10∶1，接合转移时间18～20 h，此条件下转化效率最高达到10-4。

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