气相色谱—质谱法用于人尿中4种二羧酸的含量检测

马振菁　黄建明　林绥

[摘要] 目的 建立測定人尿中有机酸二羧酸类含量分析方法。 方法 采用离子轰击（EI）离子源质谱检测尿中二羧酸含量。尿液样品前处理：采用内标法，样品先进行α-酮肟反应，再硫酸甲醇溶液进行甲酯化处理，氯仿萃取有机二羧酸。 结果 线粒体肌病组辛二酸含量均低于正常组和重症肌无力组（P < 0.05）；线粒体肌病组和重症肌无力组庚二酸含量均明显低于正常组（P < 0.05）。精密度日内RSD为1.00%～2.84%，日间RSD为2.01%～3.87%，加标平均回收率为88.47%～104.09%，RSD为1.24%～4.19%。 结论 气相色谱质谱法测定尿液二羧酸类有机酸化合物方法简便准确，重现性好，可用于帮助临床筛查肉碱循环酶缺陷遗传代谢病。

[关键词] 二羧酸；气相色谱-质谱法；线粒体肌病；重症肌无力；尿液

[中图分类号] R284.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）03（c）-0097-04

[Abstract] Objective To establish an analytical method for the determination of organic acids dicarboxylic acid in human urine. Methods The content of dicarboxylic acid in the urine was detected by ion bombardment （EI） ion source mass spectrometry. Urine sample pretreatment： by using internal standard method， the sample was taken α-ketoxime reaction first， and then sulfuric acid methanol solution was carried out the process of methyl esterification， chloroform was used for extraction of organic dicarboxylic acid. Results The content of suberic acid in mitochondrial myopathy group was lower than that in normal group and myasthenia gravis group （P < 0.05）. The concentration of pimelic acid in mitochondrial myopathy group and myasthenia gravis group were significantly lower than those in normal group （P < 0.05）. The intra-day RSD was 1.00%-2.84%， and the inter-day RSD was 2.01%-3.87%. The average recovery rate of the added standard was 88.47%-104.09%， and RSD was 1.24%-4.19%. Conclusion The method of gas chromatography-mass spectrometry for determination of urinary dicarboxylic acid organic acid compounds is simple， accurate， with good reproducibility， which can be used to help screening carnitine circulating enzyme deficiency inherited metabolic diseases in clinic.

[Key words] Dicarboxylic acid； Gas chromatography-mass spectrometry； Mitochondrial myopathy； Myasthenia gravis； Urine

随着1966年K-Tanak首先将气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC/MS）联用技术应用于遗传代谢病检测后，已在欧美等国家得到广泛应用，尿液中有机酸的异常升高或异常有机酸的出现，往往与体内这些化合物代谢的紊乱有关，其中某些有机酸异常的变化可为遗传代谢性疾病[1-4]，在遗传代谢病中肉碱循环酶缺陷影响长链脂肪酸转运，以尿中无二羧酸类代谢物为其特征，因此准确检测尿液中二羧酸类有机酸含量，对于帮助遗传代谢病筛查诊断具有重要应用价值。

尿液样品的前处理有有机酸萃取法和尿素酶法，前者主要应用于欧美国家，使用年限较长，后者是近几年由日本学者建立，经尿素酶处理后，不经有机溶剂萃取直接进行GC/MS分析，但未经有机溶剂萃取的气相色谱图的杂峰甚多，不利结果分析，且无法定量检测到脂肪二羧酸类代谢物，本研究是对尿液前处理进行改进，使得有机二羧酸类化合物提取与甲酯化在一个体系同步进行，采用GC/MS联用方法测定样本中己二酸、庚二酸、辛二酸、壬二酸的含量，现报道如下：

1 资料与方法

1.1 样品来源

45名健康人（正常组）来自福建省医学科学研究院职工和福建医科大学学生，其中男21名，女24名，年龄20～60岁。无低血糖病史，无肝、肾、脑疾病病史，无严重感染病史，无代谢性疾病病史，无心电图和脑电图异常。6例线粒体肌病患者（线粒体肌病组）为2013年6月～2017年3月福建省附属第一医院的患者，经过基因检测确诊，其中男3例，女3例，年龄9～48岁。重症肌无力12例患者（重症肌无力组）为福建省立医院2016年6月～2017年6月的就诊患者，其中男9例，女3例，年龄21～64岁。遵循程序符合人体试验委员会制订的伦理标准，获得研究对象同意，自愿签署知情同意书。

1.2 仪器与试剂

Agilent 7890A/5975气相色谱-质谱仪，配有电子轰击（EI）离子源及化学工作站（美国Agilent公司）。对照品己二酸（批号：J126G005）、辛二酸（批号：F039G005）、壬二酸（批号：P1168205）由CNW提供；庚二酸（瑞士Adamas-beta公司，批号：P1011072）；正十七酸（Sigma公司，批号：044K1647）；盐酸羟胺（Fluka公司，批号：LJ0118B0810J）；甲醇为色谱纯，浓硫酸为分析纯，氯仿为分析纯经重蒸馏处理，水为超纯水。

1.3 色谱及质谱条件

Hp-5ms（30 m×0.25 mm，0.25 μm）色谱柱，程序升温：初始40℃保持3 min，以8℃/min升温至290℃，保持3 min；以氦气为载气，流速为1.0 mL/min恒流，采用不分流进样，1 min开阀，进样口温度：260℃，传输线：290℃，采用EI离子源质谱检测；电子能量70 eV；离子源温度230℃；扫描范围：m/z 50～550，扫描方式：全扫描和选择离子扫描（SIM），溶剂延迟3.0 min。

1.4 样品前处理方法

晨尿经过2200 g离心8 min，取尿液上清液分装于冻存管中至-20℃保存直至开始实验。实验时供试样品从冰箱中取出，在室温下解冻，尿样品以3400 r/min（2200 g）离心5 min，取上清1 mL于10 mL离心管中，加入100 μL内标（568.4 mg/mL正十七烷酸），摇匀，再加入100 μL 2.5%盐酸羟胺和300 μL 10 mol/L氢氧化钠溶液，盖紧充分混匀，静止1 h。在反应体系里加入130 μL 50%硫酸酸化混匀，再2 mL 10%硫酸-甲醇液进行甲酯化反应，漩涡振荡1 min，样品置60℃水浴反应90 min。取出样品放至室温，加入1 mL超纯水，混匀，用2 mL氯仿提取有机酸甲酯，漩涡振荡2 min，2200 g离心8 min，取下层溶液经微孔有机滤膜过滤置样品瓶中，作为供试品溶液。

1.5 统计学方法

采用SPSS 23.0统计软件，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，组间用单因素方差分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 标准曲线与检出限考察

准确称取辛二酸、庚二酸、己二酸、壬二酸对照品10.0 mg，用甲醇溶液配制成1.0 mg/mL对照品储备液；储备液经过超纯水不同程度稀释后得到的不同浓度的对照品混合液按“1.4”项方法处理，在已优化的条件下做工作曲线，测定结果以对照品与内标物质峰面积比值（y）为纵坐标，以其浓度（x）为横坐标，经线性回归，得回归方程如表1所示，线性相关系数为0.991～0.998，线性关系良好。尿液中4种有二羧酸有机酸结果见表1，加对照品混合液尿液总离子流色谱图见图1。

2.3 方法学验证

在已知浓度的健康者混合尿样中分别加入1.0、10.0 μg/mL 2个浓度的混合标准溶液，按照“1.4”项进行样品前处理，并照上述质谱条件进行分析。每个浓度的混合标准溶液平行分析4次，分别计算每种浓度的日内相对标准偏差（n = 4）（RSD）为1.00%～2.84%，每个浓度的混合标准溶液制成5份，每天分析1份，计算不同浓度的日间RSD为2.01%～3.87%，计算2种浓度的加标回收率分别为88.47%～98.01%，RSD为1.59%～3.34%；96.31%～104.09%，RSD为1.24%～4.19%。见表3。

2.4 样品分析

应用本方法测定了45名健康人、6例线粒体肌病和12例重症肌无力患者的尿液中4种二羧酸类有机酸含量，结果见表4。线粒体肌病组辛二酸含量均低于正常组和重症肌无力组（P < 0.05），线粒体肌病组和重症肌无力组庚二酸含量均明显低于正常组（P < 0.05）。

3 讨论

近年来尿有机酸代谢已经引起广泛关注，研究成果与日俱增[5-11]，为了探讨尿有机酸代谢产物在疾病病因学上的作用，本研究采用GC/MS技术对线粒体肌病和重癥肌无力尿样本进行有机酸二羧酸含量分析，采用单因素方差分析，发现三组二羧酸含量有明显差异，不考虑体重因素影响，疾病组庚二酸含量均明显低于正常组（P < 0.05），线粒体肌病组辛二酸含量均低于正常组和重症肌无力组（P < 0.05），如果把体重因素加入，线粒体肌病组辛二酸含量仅低于正常组，说明体重也会影响二羧酸类代谢；从健康人的测定结果可以看出壬二酸的含量女的比男的高些，总的二羧酸类含量男女有一些差别，但都没有统计学差异，这可能跟样本数量有关。

基于质谱技术的不断发展，分析常用样品衍生化方法为硅烷化，此法衍生化物质范围广，但由于硅烷化试剂遇水立即分解，因此样品衍生化前需用氮气吹干；国内对于有机酸衍生化这块还局限于甲基硅烷化[12-13]，而甲基硅烷化对反应样品的要求是无水状态，这对提取的有机酸要求增高，成本增加，必须样品要氮气吹干，同时样品经过多次的萃取增加了操作的复杂程度，也造成损失。

在本研究中经过系列的实验选择100 μL 2.5%盐酸羟胺和300 μL 10 mol/L氢氧化钠溶液进行α-酮肟反应，此浓度搭配才能使反应进行完全，反应终止时间是1 h，已经达到了反应平台期，采用130 μL 50%硫酸是正好用来终止反应液中多余的碱量。日本学者应用滤纸收集尿标本，经尿素酶处理后，不经有机溶剂萃取直接进行GC/MS分析，用于遗传代谢性疾病新生儿群体筛查[14]，但未经有机溶剂萃取的气相色谱图的杂峰甚多，不利结果分析，且甚易污染气相色谱柱和质谱离子源，尿液有机酸萃取预处理法对各种特异性代谢产物的检出量高于尿素酶预处理法，对于后者无法检测到的脂肪二羧酸有机酸萃取预处理法仍能检测出。遗传代谢病肉碱循环酶缺陷影响长链脂肪酸转运，以尿中无二羧酸为其特征，检索了国内外还未见有其他文献报道在一个反应体系里对尿液有机酸脂肪酸萃取并甲酯化同步进行的报道，本研究是基于逼着作者原有GC测定血液游离脂肪酸的方法[15-16]基础上进行改进，减少了反复萃取的样品损失，在一个体系里直接对尿液中有机酸脂肪酸进行甲脂化后并萃取，考虑到主要用于有机酸二羧酸类分析，采用容易控制并不惧水的甲酯化反应，并具有操作简便快捷、准确度和精密度高等优点。本方法适用于帮助临床遗传代谢病中肉碱循环酶缺陷筛查诊断和预防医学分析领域生物样本中二羧酸类有机酸检测。

[参考文献]

[1] 韩连书，叶军，邱文娟，等.血尿琥珀酰丙酮检测在酪氨酸血症-Ⅰ型诊断中的应用[J].中华儿科杂志，2012，50（2）：126-130.

[2] 韩连书，毋盛楠，叶军，等.单纯型甲基丙二酸血症患者诊治分析[J].中华医学遗传学杂志，2013，30（5）：589-593.

[3] 江敏妍，刘丽，李秀珍，等.气相色谱-质谱联用技术在3-羟基-3-甲基戊二酸尿症诊断中的应用[J].实用儿科临床杂志，2012，27（20）：1557-1560.

[4] 杨楠，韩连书，叶军，等.枫糖尿病患者临床表现及质谱检测结果分析[J].中华医学杂志，2012，92（40）：2839-2842.

[5] 张万巧，彭薇，杨尧，等.气相色谱质谱法筛查先天性代谢缺陷方法及诊断标准的建立[J].中华实用诊断与治疗杂志，2015，29（11）：1059-1062.

[6] 杨楠，韩连书，叶军，等.新生儿期氨基酸、有机酸及脂肪酸氧化代谢疾病病谱分析[J].临床儿科杂志，2012，30（9）：805-808.

[7] 张琳，李玲，孔海瑞，等.基于气相色谱质谱技术的肾细胞癌患者尿液代谢组学分析[J].南方医科大学学报，2015， 35（5）：763-766.

[8] 陈艳华，张瑞萍，宋咏梅，等.基于决速高分辨液相色谱串联质谱技术的代谢组学尿液分析方法的建立[J].分析化学研究报告，2011，39（2）：173-177.

[9] 宋培培，马玉花，韩萍，等.新疆维吾尔族和汉族大学生尿液代谢轮廓差异分析[J].分析化学，2015，43（10）：1565-1568.

[10] 曾凡勇，吴卫红，刘建军，等.遗传性代谢病高危患儿尿有机酸的筛查[J].中国康复理论与实践，2016，22（8）：947-951.

[11] 韩凤，韩连书，叶军，等.气相色谱-质谱检测的564例遗传代谢病疾病谱分析[J].中华内分泌杂志，2013，29（8）：693-695.

[12] 罗小平，王慕逖，魏红，等.尿滤纸片法气相色谱-质谱分析技术在遗传性代谢缺陷病高危筛查诊断中的应用[J].中华儿科杂志，2003，41（4）：245-248.

[13] 孙卫华，杨毅，曹迪，等.气-质联用技术测定尿有机酸方法的建立及在遗传代谢病诊断中的应用[J].中华检验医学杂志，2008，31（10）：1161-1165.

[14] Fu XW，Iga M，Kimura M. Simplified screening for organic acidemias using GC/MS and dried urine filter paper：a study on neonatal mass screening [J]. Early Human Development，2000，58（1）：41-55.

[15] 馬振菁，王滔，陈发同，等.气相色谱法检测健康人血清游离脂肪酸[J].福建医学大学学报，2006，40（2）：179-181.

[16] 马振菁，王滔，陈发同，等.血浆极长链脂肪酸在肾上腺脑白质营养不良中的诊断价值及洛伐他汀对其影响[J].新医学，2009，40（9）：587-588.

（收稿日期：2017-10-17 本文编辑：张瑜杰）