TNF—α对成骨细胞程序性坏死的影响及相关机制的研究

刘凯　卓鸿武　刘建忠

[摘要] 目的 分析TNF-α对成骨细胞程序性坏死的影响并分析其机制。 方法 分离并常规培养小鼠乳鼠成骨细胞，采用TNF-α干预诱导细胞程序性坏死，Nec-1干预抑制细胞坏死。并采用正常培养的成骨细胞为正常对照组。MTT法检测细胞增殖情况；Tunel和Caspase 3双染法检测细胞的程序性坏死情况；Western blot检测细胞RIP1、RIP3、MLKL蛋白表达水平。 结果 与正常对照组比较，TNF-α组增殖活性降低，程序性坏死数量增加（P < 0.05）；与TNF-α组比较，TNF-α+Nec-1组增殖活性显著增加，程序性坏死数量降低（P < 0.05）；随着时间延长，各组之间的差异更加显著（P < 0.05）。与正常对照组比较，TNF-α组RIP3、MLKL蛋白表达降低（P < 0.05）；TNF-α+Nec-1组RIP3、MLKL蛋白表达高于TNF-α组（P < 0.05）。 结论 TNF-α能够抑制成骨细胞增殖，促进细胞发生程序性坏死，这可能是通过降低成骨细胞的RIP3、MLKL蛋白表达来完成的。

[关键词] 肿瘤坏死因子α；成骨细胞；程序性坏死

[中图分类号] R684 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）03（c）-0018-05

[Abstract] Objective To explore the effect and its related mechanism of TNF-α on programmed necrosis of osteoblasts. Methods Mice osteoblasts were isolated and cultured from suckling mice， and TNF-α was used to induce programmednecrosis of osteoblasts， Nec-1 was used to inhibit cell necrosis. Normal cultured osteoblasts were used as normal control group， and MTT assay was used to detect the cell proliferation. Tunel and Caspase 3 double staining was used to detect the programmed necrosis of osteoblasts. The expression of RIP1， RIP3 and MLKL were detected by Western blot. Results Compared with the normal control group， the proliferation activity of TNF-α group was decreased and the number of programmed necrosis was increased （P < 0.05）. After the Nec-1 treatment， the proliferative activity was significantly increased compared with TNF-α group， and the number of programmed necrosis was decreased （P < 0.05）. As time went on， the differences between the groups became more pronounced （P < 0.05）. Compared with the normal control group， expression of RIP3 and MLKL protein in TNF-α group was significantly lower than that in normal control （P < 0.05）. After the Nec-1 treatment， the expression of RIP3 and MLKL protein had significantly differences compared with TNF-α group （P < 0.05）. Conclusion TNF-α can inhibit osteoblast proliferation and promote programmed necrosis of osteoblasts， which may be accomplished by reducing the expression of RIP3 and MLKL proteins in osteoblasts.

[Key words] TNF-α； Osteoblasts； Programmed necrosis

骨質疏松症是一种全身性骨代谢性疾病，绝经后骨质疏松是以雌激素缺乏诱导破骨细胞生成为特征的疾病，是一种炎症过程[1-2]。绝经后骨质疏松产生的原因与雌激素水平下降，炎性因子表达升高有关，他们的变化可促进破骨细胞增殖分化及细胞融合，也可抑制破骨细胞凋亡，导致骨吸收增加，最终导致成骨细胞及破骨细胞偶联失衡，诱发骨质疏松[3]。肿瘤坏死因子α（TNF-α）能与细胞膜上肿瘤坏死因子受体（TNFR1）结合，激活多条信号通路，从而引起细胞炎性反应或者细胞死亡[4]。核转录因子-κB（NF-κB）作为TNF-α直接激活的下游转录因子，在TNF信号通路中起着不可或缺的作用。细胞程序性坏死是一类因病理而产生的被动死亡，发生程序性坏死的细胞表现为细胞膜通透性增高，细胞肿胀，细胞器变形或肿大，最后细胞破裂，因此被认为是无序的过程，无从进行调控[5]。研究指出，程序性细胞坏死的发生发展与TNFR家族有关[6-7]。本研究选取成骨细胞，采用TNF-α进行干预，分析TNF-α对成骨细胞程序性坏死的影响及机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

MTT（美国Sigma公司）；RPMI-1640培养基（美国Gibco公司），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；Tunel试剂盒（江苏碧云天生物有限公司），兔抗鼠受体相互作用蛋白1（RIP1）、RIP3、混合谱系激酶结构区域样蛋白（MLKL）多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG（北京中杉金桥生物技术有限公司），Caspase 3多克隆抗体（proteintech有限公司），兔抗鼠β-actin单克隆抗体（美国Sigma公司）。

1.2 主要设备

培养箱（Thermo公司），二氧化碳孵箱（SANYO公司），倒置显微镜（Nikon公司），台式低温高速离心机（Beckman公司），-80℃冰箱（SANYO公司）。

1.3实验动物

出生2～3 d的清洁级SD小鼠乳鼠30只，购自上海斯莱克公司实验动物中心，实验动物合格证号（1131800667）。

1.4 实验方法

1.4.1 成骨细胞的分离培养及鉴定 成骨细胞采用胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶消化方法的从乳鼠颅骨中提取。将细胞消化成单细胞悬液，然后调整浓度到2×105个/mL浓度。吹打均匀后，接种到培养瓶中，置于37℃，含5% CO2培养箱内进行培养。48 h换液，弃去悬浮的死细胞，每隔2 d换液。通过细胞形态，骨钙化结节染色和碱性磷酸酶细胞化学染色三方面对成骨细胞进行鉴定。

1.4.2 细胞培养 采用含有10%新生牛血清的DMEM培养基，置于5% CO2、37℃饱和湿度培养箱中培养。将培养的细胞用0.25%的胰酶消化，以105个/L接种于24孔板，待细胞长至70%～80%融合状态时，用不含血清的培养液饥饿培养24 h。待原代细胞长满瓶壁后，弃去原培养液，加入0.25%胰酶溶液3～5 min至细胞收缩变圆，加入适量培养液并用弯吸管吹打细胞，使之脱落并分散成单细胞悬液。

1.4.3 实验处理及分组 将处于对数生长期的第3代成骨细胞以1×104个/mL均匀接种于6孔培养板，每孔2 mL，置于37℃、5% CO2培养箱培养。TNF-α溶于灭菌的PBS溶液中，配制成TNF-α存储液，混匀分装，-80℃保存。正常对照组细胞正常培养，TNF-α组细胞给予10 μmol/L的TNF-α干预，培养4～6 h后换液，48 h后处理细胞。TNF-α+Nec-1组细胞除采用TNF-α进行干预外，给予程序性坏死和凋亡抑制剂Nec-1干预培养的成骨细胞，继续培养48 h。

1.4.3 MTT法检测成骨细胞的增殖活性变化 收集对数期生长的成骨细胞，用培养液调整细胞悬液的浓度，以8×104个/孔种植于细胞培养板上，设定温度37℃、5% CO2培养箱中培养。12、24、48 h后检测细胞活性。加入MTT溶液20 μL（5 mg/mL），孵育4 h，终止培养，每孔加150 μL二甲基亚砜，振荡10 min，在酶联免疫检测仪570 nm处测量各孔的吸光度（A值）。以A为纵坐标，以时间（h）为横坐标，绘制生长曲线。

1.4.4 Caspase3和Tunel双染法检测组成骨细胞的程序性坏死情况 成骨细胞铺板，给予相应的药物治疗后，PBS洗3遍，然后采用福尔马林固定10 min，之后采用山羊血清封闭20 min后，孵育Caspase 3一抗（1∶100）4℃过夜，第2天恢复到室温后，再放置30 min，PBS冲洗后，孵育FITC标记的绿色荧光二抗，洗涤后进行常规Tunel染色，按试剂盒说明书进行。采用3%过氧化氢甲醇中浸洗10 min，用0.2% Triton孵育5 min后，用PBS洗2次，切片组织上每块组织滴加50 μL的Tunel反应液，37℃避光孵育1 h，PBS洗3次后，在荧光显微镜下拍照。Caspase 3阴性Tunel阳性的细胞为坏死细胞。随机选取10个视野，计算坏死细胞百分比。

1.4.5 Western blot检测成骨细胞RIP1、RIP3、MLKL蛋白表达的变化 加0.1 mg/mL PMSF、抑肽酶和磷酸转移酶抑制剂裂解细胞，加0℃ RIPA裂解液50 μL，用细胞刮仔细刮取蛋白，4℃环境下以12 000 r/m离心30 min，吸取上清，分装后置于-80℃超低温冰箱冻存。取提取的细胞蛋白质样品加入等体积的2倍上样缓冲液，100℃煮沸5 min，在5%积层胶和10% SDS-PAGE凝胶上进行电泳分离待测蛋白。10 V半干式电转膜至PVDF膜上，根据分子量Marker观察蛋白质转移情况。TBST摇床上洗5 min，37℃用5%脱脂奶粉封闭2 h，加入抗兔一抗（β-actin、RIP1、RIP3、MLKL，稀释为1∶1000）4℃孵育过夜，TBST洗涤后，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗，室温下摇床孵育1 h，TBST洗涤后，采用ECL法进行化学发光，然后用Alphalmager TM 2200进行图像分析，结果以各目的蛋白与β-actin的灰度比值表示。

1.5 统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，重复测量资料采用重复测量方差分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 成骨细胞的增殖活性变化

处理24 h后，TNF-α组细胞增殖能力均低于正常对照组（P < 0.05），TNF-α+Nec-1组细胞增殖能力高于TNF-α组（P < 0.05）。處理48 h后，各组细胞增殖趋势没有变化，但各组间差异进一步放大（P < 0.05）。见图1。

2.2 Tunel和Caspase 3双染法检测成骨细胞的程序性坏死情况

TNF-α组细胞程序性坏死数量高于正常对照组（P < 0.05）；TNF-α+Nec-1组成骨细胞程序性坏死数量低于TNF-α组（P < 0.05）。见表1。

2.3 成骨细胞RIP1、RIP3、MLKL蛋白的表达

在处理12 h和24 h时，与正常对照组比较，TNF-α组成骨细胞RIP1表达差异无统计学意义（P > 0.05），而RIP3、MLKL蛋白表达降低（P < 0.05）；与TNF-α组比较，TNF-α+Nec-1组成骨细胞RIP1表达差异无统计学意义（P > 0.05），RIP3、MLKL蛋白表达明显上调（P < 0.05）。到48 h时，TNF-α组RIP1表达明显低于正常对照组，TNF-α+Nec-1組成骨细胞RIP1表达高于TNF-α组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图2。

3 讨论

随着人口的老龄化，骨质疏松症已成为中老年人骨痛、骨折的主要原因。目前，治疗骨质疏松的主要药物是雌激素和二膦酸盐为代表的抗骨吸收的药物，但治疗效果不尽如人意。探索骨质疏松症的发生机制，寻求更为有效的治疗方式是近几年来研究者们的关注重点。

细胞的死亡机制一直是生物医学研究的核心热点之一，目前公认的主要细胞死亡类型有“坏死”“凋亡”和“自噬”三种[8]。特别的是凋亡和自噬均需要能量和合成新的蛋白质，是一个细胞自我调控的主动过程，因此也被称为“程序性死亡”[9]，而细胞程序性坏死，则是一个被动的过程。其中由TNF-α介导的细胞坏死的分子机制及其在炎症等病理过程中的作用研究较多。本研究重点分析TNF-α对成骨细胞程序性细胞死亡的影响及机制。

本研究选取小鼠乳鼠，分离培养成骨细胞，采用TNF-α干预的动物作为模型动物处理，加入程序性坏死和凋亡抑制剂Nec-1干预的动物作为实验动物处理，正常对照组为常规培养成骨细胞。首先检测成骨细胞的增殖活性变化，TNF-α组细胞的增殖活性较正常对照组降低，TNF-α+Nec-1组在相同时间段的细胞增殖活性高于TNF-α组，但低于正常对照组，随着时间延长，TNF-α+Nec-1组细胞增殖活性略有升高。有研究指出，程序性坏死过程可被RIP1激酶抑制剂Nec-1阻断，Nec-1是最早鉴定的坏死抑制剂，可特异性抑制RIP1的激酶活性[10-11]。提示TNF-α能够抑制成骨细胞的增殖活性，细胞程序性和凋亡抑制剂Nec-1能够对TNF-α的抑增殖效应产生一定的抑制作用。本研究进一步检测成骨细胞的程序性坏死情况，TNF-α组的细胞程序性坏死数量高于正常对照组，细胞出现损伤；TNF-α+Nec-1组成骨细胞程序性坏死数量低于TNF-α组，但高于正常对照组；随着时间延长，TNF-α+Nec-1组细胞程序性坏死数量略有升高。研究表明，细胞坏死是一种受到精密调控的“新型”程序性细胞死亡方式[12]。当细胞凋亡不能正常发生而细胞必须死亡时，坏死可以作为凋亡的“替补”方式被激活。相关研究提示，程序性细胞坏死在中风、心肌梗死、缺血/再灌注损伤、动脉硬化等多种人类疾病病理学中发挥着重要的作用[13-15]。在非酒精性脂肪性肝病患者中程序性坏死升高，脂肪型肝炎的动物模型中TNF-α导致的氧化应激损伤有RIP3依赖的肝细胞程序性坏死发生[16]。本研究结果提示，TNF-α能够促进成骨细胞的发生程序性细胞坏死，Nec-1能够抑制成骨细胞的程序性坏死发生。为了研究TNF-α对成骨细胞程序性细胞死亡的影响机制，本研究最后检测成骨细胞RIP1、RIP3、MLKL蛋白的表达，相同时间段比较，在12 h和24 h各组成骨细胞RIP1表达无明显改变；TNF-α组RIP3、MLKL蛋白表达正常对照组，TNF-α+Nec-1组RIP3、MLKL蛋白表达高于TNF-α组。既往研究指出，程序性细胞坏死主要由TNFR家族以及Toll样受体家族启动，并通过和受体蛋白相互作用的两个蛋白激酶RIP1和RIP3传递死亡信号，募集并磷酸化MLKL，而MLKL作为细胞死亡的执行者，最终会导致坏死的发生，坏死的细胞会向周围释放其内容物，这些内容物作为DAMPs可刺激周围细胞发生炎性反应，激活机体免疫应答[17-18]。研究表明，TNF-α既可以通过激活NF-κB诱导细胞生存途径，也可以通过RIP1诱导Caspases依赖性的细胞凋亡，RIP1在该信号通路中的功能相当是下游信号通路的一个支架蛋白是不依赖于其激酶活性的[19]。当RIP3和MLKL的表达水平足够高时，RIP3和RIP1会通过它们各自的RHIM结构域相互结合，活化的RIP3募集MLKL，激活坏死途径[20]。本研究结果表明，TNF-α可能是通过降低成骨细胞的RIP3、MLKL蛋白表达来达到抑制成骨细胞增殖，促进成骨细胞发生程序性坏死的目的，而Nec-1能够对TNF-α的效应产生一定的抑制作用。

可见，TNF-α能够抑制成骨细胞的增殖活性，促进成骨细胞的发生程序性细胞坏死，细胞程序性和凋亡抑制剂Nec-1能够对TNF-α的抑增殖和促凋亡效应产生一定的抑制作用，这可能是通过降低成骨细胞的RIP3、MLKL蛋白表达来完成的。骨质疏松症在临床上较为常见，发病率高，如何通过进一步的研究及分析寻找更为有效的治疗手段对临床治疗来说至关重要。未来可进一步从分子、基因角度进行分析，探索更多的细胞因子、蛋白基因与骨质疏松症发生发展的关系及相关的信号通路调控，以求探索到更佳的诊疗方向，促进患者恢复健康。

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（收稿日期：2018-02-15 本文編辑：李岳泽）