远程缺血预处理对兔脊髓缺血再灌注损伤的保护作用及其机制

余奇劲　田文华　杨云朝

[摘要] 目的 探討远程缺血预处理（RIPC）对兔脊髓缺血再灌注损伤（SCIRI）的保护作用及其机制。 方法 36只日本大耳白兔随机双盲均分为假手术组（S组）、缺血再灌注损伤组（IR组）、IR+RIPC组，每组12只动物。S组不阻断腹主动脉，IR组和IR+RIPC组夹闭腹主动脉30 min建立SCIRI模型，IR+RIPC组于主动脉阻断前1 h实施RIPC。三组动物在再灌注2 d和5 d行后肢神经功能评分后处死并取脊髓组织L3～L5段，评估病理学变化；同时检测SOD1活性和SOD1 mRNA的表达水平。 结果 同一时间点，IR组后肢神经功能评分和脊髓组织病理切片分级与 S组相比，显著降低（P < 0.01）；而IR+RIPC组后肢神经功能评分和脊髓组织病理切片分级与IR组相比，则明显改善，差异均有高度统计学意义（P < 0.01）；术后第2天，与S组比较，IR+RIPC组SOD1活性和SOD1 mRNA的表达水平均显著升高，差异均有高度统计学意义（P < 0.01），而IR组则无明显变化（P > 0.05）；术后第5天，与S组比较，IR组SOD1活性和SOD1 mRNA的表达水平均显著降低，差异均有高度统计学意义（P < 0.01），而IR+RIPC组则无明显变化（P > 0.05）；与IR组比较，IR+RIPC组SOD1活性和SOD1 mRNA的表达水平均显著升高，差异均有高度统计学意义（P < 0.01）；IR组、IR+RIPC组脊髓组织SOD1 mRNA表达变化与SOD1活性的变化呈正相关（R=0.96、0.97，均P < 0.01）。 结论 RIPC对兔SCIRI有一定的防治作用，其机制与增强脊髓组织缺血性损伤区域中SOD1的表达有关。

[关键词] 远程缺血预处理；脊髓；缺血再灌注损伤；超氧化物歧化酶-1

[中图分类号] R743.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）03（c）-0008-05

Protective effect of remote ischemic preconditioning on spinal cord ischemia reperfusion injury and its possible mechanism in a rabbit model

YU Qijing1 TIAN Wenhua2 YANG Yunzhao1

1.Department of Anesthesiology， Renmin Hospital of Wuhan University， Hubei Province， Wuhan 430060， China； 2.Department of Anesthesiology， Wuhan Hospital of Traditional Chinese Medicine， Hubei Province， Wuhan 430000， China

[Abstract] Objective To investigate the protective effect of remote ischemic preconditioning （RIPC） on spinal cord ischemia reperfusion injury （SCIRI） and its possible mechanism in a rabbit model. Methods Thirty-six rabbits were randomly divided into sham operation group （Sham group）， ischemia reperfusion group （IR group）， IR+ RIPC group， 12 rats in each group. On the 2 sec and 5th day after reperfusion， 6 animals were sacrificed respectively. Animals in Sham group were exposed abdominal aorta （without interruption）， IR group and IR+RIPC group received abdominal aortic clamp 30 min， and established SCIRI model. IR + RIPC group underwent RIPC before aortic clamp 1 h. All animals were evaluated for hindlimb function scores in postoperative 2 days and 5 days， according to the Tarlov standard， and then were sacrificed and the L3 - L5 segment of the spinal cord were detected to observe the pathological changes of spinal cord tissues. Meanwhile， the SOD1 activity and the expression level of SOD1 mRNA were detected. Results On the same timepoint， compared with the Sham group， the neurological function scores and pathological grading of spinal cord tissue in IR group were significantly decreased （P < 0.01）， but compared with the IR group， the neurological function scores and pathological grading of spinal cord tissue in IR+ RIPC group were significantly improved （P < 0.01）. On the second day after operation， compared with the Sham group， the activity of SOD1 and the expression level of SOD1 mRNA in the IR+RIPC group were all significantly increased （P < 0.01）， whereas there was no significant change in the IR group （P > 0.05）. On the 5th day after operation， compared with the Sham group， the activity of SOD1 and the expression level of SOD1 mRNA in the IR group were all significantly decreased （P < 0.01）， and there was no significant change in the IR+RIPC group （P > 0.05）. Compared with IR group， the SOD1 activity and the expression level of SOD1 mRNA were all significantly increased in the RIPC group （P < 0.01）. The change of SOD1 mRNA expression in spinal cord was positively related to the change of SOD1 activity in IR group or IR+ RIPC group （R=0. 96 or 0.97， all P < 0.01）. Conclusion RIPC has a certain preventive effect on rabbit SCIRI， and its mechanism is related to enhancing the expression of SOD1 in ischemic region of spinal cord tissues.

[Key words] Remote ischemic preconditioning； Spinal cord； Ischemia reperfusion injury； Superoxide Dismutase-1

缺血预处理（ischemic preconditioning，IPC）已经被大量的实验或临床研究证实：对多种组织器官的缺血性损伤具有保护效果[1-3]。我们早期研究发现，阻断腹主动脉实施多次IPC对脊髓缺血再灌注损伤（spinal cord ischemic reperfusion injury，SCIRI）具有显著的保护作用[4]。然而，腹主动脉多次被阻断在临床应用不切实际，而且反复钳夹主动脉存在血管损伤的风险。目前已成共识，IPC的保护作用不仅局限于直接缺血的组织，而且还在远端组织呈现，这种现象被定义为远程缺血预处理（remote ischemic preconditioning，RIPC）作用[2-3]。目前，RIPC用于防治SCIRI的研究鲜有报道，本项目以动物模型探讨RIPC防治SCIRI效果及其机制。

1 对象与方法

1.1 实验过程

日本大耳白兔 36只[武汉大学人民医院中心实验室提供，动物批号：SCXK2015-003，动物合格证号：No.00010387]，雄性，3～4月龄，普通级，体量2.2～2.5 kg，普通环境饲养，健康状况良好。经耳缘静脉输注平衡盐液8 mL/（kg·h）。静脉麻醉推注3%戊巴比妥钠1.0 mL/kg（由中国医药集团上海化学试剂公司提供，批号：F20020915，用生理盐水配备为3%浓度备用），保留呼吸，经口气管插管，静脉注射肌肉松弛剂维库溴铵1.0 mg/kg（海南斯达制药有限公司生产，批号：1212022），接动物呼吸机，控制呼吸，频率30次/min，吸呼比为1︰2。间断注射3%戊巴比妥钠（0.5 mL/kg）和维库溴铵（0.5 mL/kg）维持麻醉。肝素化后，监测腹主动脉阻断近心端和远心端的血压和心电图，物理保温保持直肠温度38℃。所有动物实验前后肢运动功能均正常。术毕动物清醒，拔除气管导管，肌内注射青霉素40万U，归笼饲养。本实验获武汉大学人民医院动物研究机构审查委员会批准，按实验室动物维护、使用的指导建議和要求处理动物。

1.2 分组方法

36只动物采取随机数字表法双盲均分为假手术组（S组，n=12）、缺血再灌注损伤组（IR组，n=12）、IR+RIPC组（n=12）。在再灌注2 d和5 d时，每组各处死6只动物。S组仅手术分离腹主动脉；IR组和IR+RIPC组参照我们既往方式制造SCIRI[4]，即：于右侧股动脉近心端用动脉压迫止血器阻断股动脉血流，持续5 min；然后恢复股动脉血流5 min。重复以上操作（缺血5 min再灌注5 min）4次，累计40 min；IR + RIPC组于夹闭主动脉前1 h实施RIPC。

1.3 监测指标

1.3.1 后肢神经功能评分 再灌注2 d和5 d时由1位对动物分组不知情的研究生采用改良Tarlov脊髓损伤评分标准[4]，对所有动物进行后肢神经功能评分。

1.3.2 脊髓组织病理学检测 后肢神经功能评分结束即刻处死动物（2个时点每组各 6 只），取部分脊髓组织（L4～L5段），制作HE染色切片72张（每个标本2张），由对动物分组不知情的同一位病理医师在光镜下（400×）按Naslund等[5]的分级标准进行分级。

1.3.3 脊髓组织SOD1活性检测 取脊髓组织（L3～L4段）100 mg制作组织匀浆，离心取适量上清液，用SOD1 ELISA试剂盒（武汉华美生物工程有限公司，CSB-EL022397RB）检测SOD1活性。

1.3.4 脊髓组织SOD1 mRNA表达水平的测定 取脊髓组织（L3～L4段）采用实时荧光定量法（RT-PCR）测定SOD1 mRNA与β-actin的相对表达量。蛋白的引物核苷酸由Invitrogen Biotechnology Co.，LTD中国公司合成（表1）。RT-PCR操作步骤：①提取样本总RNA，制成RNA溶液。取100 mg脊髓组织置入渗有1 mL的Trizol Reagent匀浆器中充分研磨，加入250 μL三氯甲烷充分混匀，静置3 min；4℃于1300 g离心8 min，取上清液于新的离心管中并加入0.8倍体积的异丙醇混匀，-20℃放置15 min，4℃于1300 g离心10 min，管底白色沉淀即为RNA；再通过洗涤、离心，加无RNA酶的水溶解RNA。②反转录。取2 μg RNA溶液置于PCR管中，加入1 μL oligo（dT）15，再加入无核糖核酸酶的去离子水至12 μL，放入PCR仪上70℃保温5 min，在迅速于冰上冷却；依次加入4 μL 5×buffer，2 μL 10 mmol/L dNTPs，1 μL RNA inhibitor和1 μL反转录酶，用枪抽吸混匀；然后再放入PCR仪上42℃保温30 min，后于80℃保温5 min灭活反转录酶。③定量PCR。先取0.2 mL PCR管，配制反应体系，每个反转录产物配制3管；依次加2×qPCR Mix 12.5 μL、2.5 μmol/L基因引物2.0 μL（或2.5 μmol/L内标引物2.0 μL）、反转录产物2.0 μL、ddH2O 8.5 μL；再行PCR扩增，预变性95℃ 1 min后，95℃ 15 s，58℃ 20 s，72℃ 20 s，循环40次；末段延伸72℃，5 min，溶解曲线每20 s升温1℃，由72℃升至95℃。④计算基因的表达量。根据ΔCT=CT目的基因-CTβ-actin，△△CT=△CT实验-△CT对照，扩增倍数=2-△△CT计算目的基因与β-actin相对表达量。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验或非参数秩和检验；两变量间关系分析采用线性回归分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 再灌注2 d和5 d时各组动物后肢神经功能评分比较

再灌注2 d和5 d时，IR组后肢神经功能评分与S组相比显著降低（χ22d = 123.2，χ25d = 128.7，均P < 0.01）；IR + RIPC组与IR组相比则显著改善（χ22d = 117.2，χ25d= 128.7，均P < 0.01）；IR + RIPC组与S组相比差异无统计学意义（P > 0.05）。见表2。

2.2 三组动物脊髓组织病理学变化比较

S组再灌注2 d和5 d时脊髓组织神经元结构基本正常（图1A、B）。IR组再灌注2 d神经元结构严重破坏，胞核几乎全部溶解、胶质颗粒显著增多（图1C）；5 d时神经元胞核完全溶解（图1D）。IR + RIPC组再灌注2 d少数脊髓神经元轻微病变，尼氏体基本清晰，偶尔可见空泡（图1E）；IR + RIPC组再灌注5 d脊髓神经元形态结构几乎接近正常或完全正常（图1F）。

与S组比较，IR+ RIPC组再灌注2 d和5 d病理切片Naslun d分级结果均无明显变化（P > 0.05），而IR组再灌注2 d和5 d差异均有高度统计学意义（χ22d = 263.5，χ25d= 298.2，均P < 0.01）；与IR组比较，IR+ RIPC组再灌注2 d和5 d则均显著改善（χ22d= 272.6， χ25d= 298.2，均P < 0.01）。见表3。

2.3 三组脊髓组织SOD1活性和SOD1 mRNA检测结果比较

再灌注2 d，与S组比较，IR+ RIPC组SOD1活性显著增强（t=12.288，P < 0.01），且SOD1 mRNA的表达水平显著升高（t=15.169，P < 0.01），而IR组二者有升高趋势而差异均无统计学意义（P >0.05）；再灌注5 d，与S组比较，IR组SOD1活性显著降低（t=26.202， P < 0.01），且SOD1 mRNA的表达显著减弱（t=26.886， P < 0.01），而IR+ RIPC組二者均无明显变化（P >0.05）；与IR组比较，IR+ RIPC组SOD1活性显著增强（t=37.220，P < 0.01），且SOD1 mRNA的表达显著升高（t=26.373，P < 0.01）。见表4。

2.4 相关性分析

IR组、RIPC组中，SOD1 mRNA相对变化量与SOD1活性相对变化量均呈正相关（R =0.96、0.97，均P < 0.01）。

3 讨论

胸腹主动脉瘤、主动脉缩窄、脊柱和骨盆肿瘤等外科手术期间，为创造有利的手术视野和控制术中出血，常需阻断主动脉血流，然而主动脉血流阻断超过一定时限即可并发SCIRI[6-8]。针对如何有效地避免围术期SCIRI的发生，国内外相关医务或科研人员已经开展了大量的研究工作[9]。然而，主动脉阻断手术期间仍有较高的SCIRI发病率[10]。研发新的有效且实用的SCIRI防治手段，无疑具有重要临床意义。本研究结果显示：IR + RIPC组实验动物的后肢神经功能评分明显增高，脊髓损伤病理学改变明显减轻，甚至逆转正常。这些事实说明RIPC对日本大耳白兔SCIRI具有显著的防治作用，对RIPC临床转化应用具有启示作用。

本研究还进行了RIPC防治日本大耳白兔SCIRI的机制探讨。在SCIRI期间，受损脊髓组织发生显著的脂质过氧化反应，从而活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）不可避免地大量出现。适量的ROS对机体正常的新陈代谢有利，然而超量的ROS却对机体极为不利。超过机体承受量的ROS可以引发急剧的氧化应激反应、脂质过氧化反应，破坏正常DNA，导致受损区域组织细胞功能障碍，出现凋亡或坏死[11-12]。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）特异性的催化组织中ROS而产生歧化反应，将ROS转变为无毒的氧化物或氧气。在脑和脊髓组织中，SOD主要以SOD1和SOD2两种形式存在，其中SOD1约占总SOD含量的85%，其是清除ROS的主力军[13]。研究已经发现[14]：若能够增强中枢神经系统中SOD1活性，则神经元发生过度氧化应激反应可被阻止，最终达到防治神经元受损的作用。

依据以上研究结果推测：中枢系统神经元的损害与组织中SOD1活性的调节密切相关，通过调控脊髓组织中SOD1的表达可以防治SCIRI。外源性SOD1细胞膜渗透性和选择性极差，因此，其不能直接通过血脑屏障。外源性SOD1只有被转化为载体结构，借助载体形式而透过血脑屏障。目前研究最多的载体肽为PEP-1，其可以与SOD1结合而成PEP-1-SOD1融合蛋白。PEP-1-SOD1可直接通过血脑屏障而发挥神经保护效应[15]。Eum等[16]研究证实：PEP-1-SOD1腹腔给药能一定程度地防治沙鼠脑短暂缺血所致的海马神经元凋亡。运用PEP-1-SOD1有效治疗物理创伤性脊髓损伤也有报道[17]。同时，Kim等[18]研究也证实，腹腔注射一定剂量的PEP-1-SOD1对SCIRI具有显著的防治作用。然而PEP-1-SOD1需要复杂的生物工程方法合成，同时国内学者合成PEP-1- SOD1的技术已经申请国家专利[19]，借助他们的帮助或者购买制备好的PEP-1-SOD1，程序复杂或者成本颇高。相比之下，本研究结果提示：RIPC可以有效地调控兔脊髓组织内源性SOD1的表达，从而有效防治SCIRI；同时，下肢RIPC操作不影响脊髓的血供，而且RIPC作用之后的远端器官或组织即刻恢复了正常血流，无缺血性损伤的风险。这些说明，RIPC这种方式具有进一步深入研究的价值。

本研究结果表明，RIPC通过增强脊髓缺血损害区域SOD1 的表达而提升脊髓组织对抗缺血伤害能力。在既往动物实验中[20]，学者发现缺血前和缺血后Propofol联合运用可有效防治SCIRI，Propofol干預可通过激活PI3K/AKT信号转导通路而影响SCIRI时脊髓组织SOD1的活性。然而，临床实践中Propofol只有在较大剂量应用时，才能有效防止机体器官缺血再灌注损伤[21]，同时Propofol在较大剂量应用时伴随一些严重的相关并发症。与RIPC相比，运用Propofol 预处理防治围术期SCIRI存在极大的缺陷；然而在患者下肢实施RIPC，能否激发脊髓组织产生足够的内源性SOD1而对抗潜在的SCIRI，尚需开展临床多中心的科研合作和大数据分析。我们目前的动物实验结果无疑为进一步的临床研究提供了实验理论依据。

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（收稿日期：2018-01-26 本文編辑：任 念）