槐花药效成分含量比较相关性研究

连优优 叶菲菲 吕伟旗 兰海娟

槐花系豆科植物槐Sophora japonica L.的干燥花，味苦，微寒，归肝、大肠经，具有凉血止血，清肝泻火等功效，用于便血、痔血、血痢、崩漏、吐血、衄血、肝热目赤、头痛眩晕等症[1-3]。化学与药理学研究[4-9]表明，槐花含有黄酮苷、脂肪酸、挥发油、氨基酸、糖类等多种药效成分，具有降血压[10]、扩张冠状动脉[11]、抗氧化[12]、抗菌[13]、抗病毒[14]、止血[15]等多种作用。槐花在我国南北各地区广泛栽培，分布较广，其中以华北和黄土高原地区尤为多见，因栽培地南北跨度大，不同地区栽培的槐花在物候期、农艺性状、药效成分含量等方面存在差异。总黄酮、芦丁是2015年版《中国药典》规定的槐花药材含量测定指标，笔者收集了陕西、河南、甘肃、浙江等9省24个产地槐花药材，采用紫外分光光度法与HPLC法测定样品总黄酮、芦丁、槲皮素、山柰酚含量，并分析了经纬度、海拔与药效成分间的相关性，以期为槐花药材高效优质栽培与优良品种选育提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 UV-9000S型紫外可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）；600-2998型高效液相色谱仪（美国Waters公司）；Milli-Q Academic超纯水仪（美国Millipore公司）；DGG-9070电热恒温鼓风干燥器（上海森信试验仪器有限公司）；FA2004型电子分析天平（上海恒平精密电子仪器有限公司）；JKWB-2A数显恒温水浴锅（上海精学科学仪器有限公司）；RE-2000E旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；KQ5200DE型数控超声清洗仪(昆山超声仪器有限公司)；FW135型中药粉碎机（上海隆拓仪器设备有限公司）。

芦丁对照品（Rutin，纯度>98%，上海源叶生物科技有限公司，批号：B20771）；槲皮素对照品（Quercetin：纯度>98%，上海源叶生物科技有限公司，批号B20527）；山柰酚（Kaempferol：纯度>98%，上海源叶生物科技有限公司，批号B21126）；甲醇（色谱级，纯度>99.9%，国药集团化学试剂有限公司，批号400642922）；甲醇、乙醚（国药集团化学试剂有限公司）；水为去离子水，其它试剂均为分析纯。供试药材2016年7月—2016年9月采自陕西、安徽、河南、浙江、湖北等不同产地，经丽水市人民医院兰海娟副主任药师鉴定为豆科植物槐Sophora japonica L.的花，见表1。

表1 供试不同产地槐花药材统计

1.2 总黄酮含量测定

1.2.1 标准曲线的绘制 精密称取芦丁对照品25mg，置25mL容量瓶中，甲醇定容至刻度。精密量取20mL，置100mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得浓度为0.20mg/mL的对照品溶液。精密量取对照品溶液 0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL，置 25mL 容量瓶中，加水补足至6mL，加5%亚硝酸钠溶液1mL，混匀，静置6min，加10%硝酸铝溶液1mL，混匀，静置6min，加氢氧化钠溶液10mL，加水至刻度，摇匀，静置15min，以相应甲醇试剂为空白，在500nm波长下测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，见表2。

1.2.2 总黄酮含量测定 按照2015年版《中国药典》方法[1]提取样品总黄酮，按照“1.2.1”项“加水补足至6mL”起，测定吸光度，按照标准曲线方程计算样品中总黄酮含量。

1.3 芦丁、槲皮素、山柰酚含量测定

1.3.1 色谱条件与系统适应性试验 色谱柱Waters Xbridge C18（4.6mm×250mm，5μm）；流动相为甲醇A:0.1%乙酸水 B，梯度洗脱（V/V：0～10min，20:80；10～13.5min，45:55；13.5 ～30min，45:55；30 ～32min，60:40；32～45min，20:80）；流速：1.0mL/min；检测波长：360 nm；柱温：30℃；进样量：20μL。

1.3.2 混合对照品溶液的制备 分别精密称取芦丁、槲皮素、山柰酚对照品溶液32.6mg、10.6mg、8.0mg置50mL容量瓶，配制成芦丁、槲皮素、山柰酚浓度为 652μg/mL、212μg/mL、160μg/mL 的单一对照品溶液，取芦丁对照品溶液25mL、槲皮素对照品溶液5mL、山柰酚对照品溶液2mL于50mL容量瓶，甲醇定容至刻度，配制成每1mL含芦丁326μg/mL、槲皮素21.2μg/mL、山柰酚6.4μg/mL的混合对照品溶液。

1.3.3 供试品溶液的制备 精密称取样品粉末0.1g，置带塞锥形瓶中，精密加入95%甲醇50mL，称定重量，25℃下超声提取（功率250W，频率25kHz）30min，放冷，补足差重，摇匀过滤。精密吸取滤液2mL于10mL容量瓶中，95%甲醇定容至刻度，即得供试品溶液。

1.3.4 线性关系考察 精密吸取混合对照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL 于 10mL 容量瓶中，甲醇定容至刻度，在“1.3.1”色谱条件下测定芦丁、槲皮素、山柰酚峰面积，以峰面积Y为纵坐标，质量浓度X为横坐标，绘制标准曲线，本试验芦丁、槲皮素、山柰酚标准曲线方程见表2。

1.3.5 样品含量测定 取适量供试品溶液，过0.45μm微孔滤膜，在“1.3.1”色谱条件下测定芦丁、槲皮素、山柰酚峰面积，按“1.3.4”标准曲线换算含量，试验重复3次。

1.3.6 稳定性试验 随机取S14样品，室温条件下按“1.3.3”方法制备供试品溶液，按“1.3.1”色谱条件下分别于 0、2、4、6、8、10、12、24h 进样，测得 S14 样品芦丁、槲皮素、山柰酚峰面积RSD值分别为0.68%、1.44%、0.92%，表明供试品溶液在室温下24h内稳定性良好。

1.3.7 精密度试验 取混合对照品溶液，按“1.3.1”色谱条件下连续进样6次，测得混合对照品溶液芦丁、槲皮素、山柰酚峰面积RSD值分别为0.24%、0.32%、0.55%，表明仪器精密度良好。

1.3.8 重复性试验 随机取S7样品6份，室温条件下按“1.3.3”方法制备供试品溶液，按“1.3.1”色谱条件下测定芦丁、槲皮素、山柰酚含量，得该样品芦丁、槲皮素、山柰酚平均含量为6.58%、1.24%、0.1647%，RSD值分别为1.10%、1.39%、1.65%，表明本试验方法重复性良好。

1.3.9 加样回收率试验 取已知含量的S3样品，加入适量芦丁、槲皮素、山柰酚对照品，按“1.3.3”方法制备供试品溶液，按“1.3.1”色谱条件测定芦丁、槲皮素、山柰酚含量，计算加样回收率（%）=（C-A）/B×100%，A为该样品中待测成分含量，B为待测成分加入对照品含量，C为实际测得量，6次重复，芦丁、槲皮素、山柰酚平均加样回收率与RSD值详见表3。

1.4 统计学方法 应用SPSS17.0、DPS7.05软件处理数据，采用单因素ANOVA分析，聚类分析采用加权配对算术平均法（WPGMA）。

表2 槐花主要药效成分标准曲线方程

2 结果与分析

2.1 槐花药效成分含量HPLC法优化 分别对芦丁、槲皮素、山柰酚色谱峰进行吸收光谱全波长扫描，结果发现芦丁在257nm与356nm处，槲皮素在254nm与370nm处，山柰酚在265nm与367nm处有较强吸收值，综合选择360nm作为槐花芦丁、槲皮素、山柰酚含量检测波长。在现有研究[1，4，16-18]基础上，对槐花芦丁、槲皮素、山柰酚提取工艺进行了优化，分别考察了甲醇浓度为85%、90%、95%、100%，提取时间为 20、30、40min，提取温度 20、25、30、35℃对芦丁、槲皮素、山柰酚提取含量的影响，结果表明，用95%甲醇，25℃超声（功率 250W，频率 25kHz）提取30min即可提取完全，本方法操作简便、快捷，所得供试品溶液中杂质含量低，不干扰药效成分的检测。同时，比较了HPLC流动相甲醇——水、甲醇——0.1%乙酸水、甲醇——0.3%磷酸水及流动相比例，发现在色谱柱Waters Xbridge C18（4.6mm×250mm，5μm），流动相为甲醇A:0.1%乙酸水B，梯度洗脱（V/V：0～10min，20:80；10 ～13.5min，45:55；13.5 ～30min，45:55；30～32min，60:40；32～45min，20:80），流速为 1.0mL/min，柱温为30℃，进样量为20μL的色谱条件下洗脱效果较好，芦丁、槲皮素、山柰酚理论塔板数均大于2500，分离度大于1.5，色谱图见图1。

2.2 不同产地槐花药效成分含量比较 供试24个产地间槐花总黄酮、芦丁、槲皮素、山柰酚含量差异均有统计学意义（P＜0.01），见表4。供试样品平均总黄酮、芦丁、槲皮素、山柰酚含量分别为10.50%、7.92%、1.33%、0.1385%，其中甘肃渭源样品总黄酮、芦丁、槲皮素、山柰酚含量均最高，分别为13.24%、9.84%、1.68%、0.1658%，浙江临安总黄酮与山柰酚含量、安徽岳西芦丁含量、河南巩义槲皮素含量最低，分别为8.31%、0.1047%、6.25%、1.04%。供试槐花样品总黄酮、芦丁含量均满足2015年版《中国药典》不低于8.0%、6.0%的标准。从药效成分含量看，供试9省24个产地槐花药材品质较好，遗传多样性丰富，为槐花良种选育奠定了基础。

2.3 相关性分析 产地的环境因子对中药材药效成分含量积累具有一定的影响，包括海拔、温度、经纬度、光照等[19]。本试验分析显示，槐花产地海拔、经纬度与药效成分含量存在相关性，经度与槐花药效成分含量呈负相关关系，海拔、纬度与槐花药效成分含量呈正相关关系；其中纬度与总黄酮、芦丁含量间相关性较大，相关系数分别达到0.7432、0.6769，海拔与槲皮素、山柰酚含量间相关性较大，相关系数分别达0.6583、0.4295，详见表5。槐花药效成分相关性分析显示，高海拔、低经度、高纬度地区栽培槐花有利于总黄酮、芦丁、槲皮素、山柰酚含量积累。

表3 芦丁、槲皮素、山柰酚加样回收率试验（n=6）

图1 高效液相色谱图

表4 不同产地槐花药效成分比较（%）

表5 槐花药效成分含量相关性分析

2.4 聚类分析 以总黄酮、芦丁、槲皮素、山柰酚含量为参考指标，对24个产地槐花样品进行聚类分析，根据欧式距离D2=2.24将供试样品分成3大类（图2）。第Ⅰ大类共9个样品，分别为陕西周至、陕西蓝田、河南荥阳、河南登封、湖北恩施、江西玉山、江西婺源、湖北孝昌、宁夏同心，该类群槐花以陕西、河南、江西、湖北样品为主，药效成分含量较高；第Ⅱ大类共5个样品，分别为陕西柞水、甘肃会宁、甘肃景泰、宁夏靖远、甘肃渭源，该类群槐花以甘肃样品为代表，样品药效成分含量最高；第Ⅲ大类10个样品，分别为河南巩义、浙江三门、安徽潜山、浙江武义、浙江缙云、浙江余姚、浙江遂昌、安徽岳西、浙江临安、福建浦城，该类群槐花以浙江、安徽样品为代表，样品药效成分较低。

图2 槐花聚类分析图

3 讨论

槐花是我国传统民间用药，具有显著的清肝泻火、清热凉血功效，已被广泛应用于临床实践。同时，槐花含有蛋白质、氨基酸、微量元素等多种营养成分，具有重要的食疗应用价值。但是由于槐花资源分布广，药材质量差异大，导致市场上槐花药材良莠不齐，行业缺乏药材统一质量评价标准，影响槐花产业健康发展。本试验收集我国槐花主分布区药材资源，对其进行质量评价，并分析经纬度、海拔与药效成分间相关性，对筛选槐花优良种质，高产优质栽培等研究均有重要意义。本试验考察了溶剂浓度、提取时间、提取温度、检测波长、流动相比例等槐花药效成分提取与检测工艺，优化了槐花芦丁、槲皮素、山柰酚含量测定HPLC方法，该方法操作简便、检测准确、重复性好，可用于槐花药材质量评价。

药用植物在长期适应环境的过程中，通过调控次生代谢产物的积累，抵抗害虫、物理、化学等生物性与非生物性环境因子胁迫，其生物学性状、生态适应性、农艺性状、药效成分等受自身遗传与环境因子双重影响，种源、经纬度、海拔、气候条件等环境因子是影响中药材生长与药效成分含量积累的重要因素[20-21]。本试验结果表明，我国槐花产区栽培槐花药材中药效成分含量均符合2015年版《中国药典》中总黄酮、芦丁含量不低于8.0%、6.0%的标准；24个产地槐花中总黄酮、芦丁、槲皮素、山柰酚含量均存在显著差异（P＜0.01），甘肃、陕西、宁夏产槐花中药效成分含量较高，浙江、安徽产槐花中药效成分含量较低；经度与槐花药效成分含量呈负相关关系，海拔、纬度与槐花药效成分含量呈正相关关系；槐花分布地域广，本试验收集了24个产地种质资源，其中如福建种质，仅收集到1个样品，代表性弱，后续工作将加强对福建、河北、重庆等地槐花的种质资源收集。从本试验收集的24个产地槐花药效成分含量看，高海拔、低经度、高纬度地区种植槐花有利于药效成分含量积累，槐花优良种质筛选可优先考虑甘肃、陕西与宁夏种质。

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