高效液相色谱法同时测定饲料香味剂中肉桂醛、丁香酚、香芹酚和百里香酚含量的研究

任玉琴，张晓丽

（浙江省兽药饲料监察所，浙江杭州 311199）

肉桂醛、丁香酚、香芹酚和百里香酚属调味和诱食类。该类添加剂的适量添加具有掩盖饲料不良气味，增加饲料的适口性，提高采食量，并具有优异的抗菌、抗氧化、防霉、防腐等抗菌活性（李京晶，2006）。目前，已有多家企业生产含4种香味剂的混合型饲料添加剂，深受饲料生产企业及畜禽养殖场的欢迎。

近年来，研究报道较多集中在饲料香味剂对畜禽采食行为和采食量的影响 （杨晶晶，2016；孙伟明，等 2015；吕继蓉等，2011）。 董茂峰（2015）和杨希国（2010）等分别利用气相色谱和高效液相色谱法测定了饲料香味剂中的香芹酚和百里香酚；李会荣（2017）等利用气相色谱法测定了饲料香味剂中的麝香草酚，丁香酚和香兰素。但对饲料香味剂中肉桂醛、丁香酚、香芹酚和百里香酚4种有效成分同时测定鲜有报道。本研究建立了采用甲醇提取、高效液相色谱法同时测定饲料香味剂中肉桂醛、丁香酚、香芹酚和百里香酚的含量，本方法简便、准确、重现性好。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器和设备 安捷伦1260高效液相色谱仪（配二极管阵列检测器）；Mettler Toledo电子天平；超声波清洗器。

1.1.2 试剂 乙腈（色谱纯），甲醇（分析纯）。

1.1.3 标准物质 肉桂醛对照品：纯度≥98.9%（Dr.Ehrenstorfer公司）；丁香酚对照品：纯度≥99.5%（Dr.Ehrenstorfer公司）；香芹酚对照品：纯度≥98.0%（Sigma公司）；百里香酚对照品：纯度99.5%（Dr.Ehrenstorfer公司）。

1.1.3.1 标准储备液配制 精密称取50 mg肉桂醛、500 mg丁香酚、500 mg香芹酚、500 mg百里香酚，分别置于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，制成浓度为1.0mg/mL的肉桂醛标准储备液，10.0mg/mL的丁香酚、香芹酚、百里香酚标准储备液。临用前用甲醇稀释。

1.1.3.2 标准工作液配制 准确移取肉桂醛、丁香酚、香芹酚、百里香酚标准储备液适量，用甲醇稀释， 分别配制成肉桂醛浓度为 0.2、1、5、10、20μg/mL，丁香酚、香芹酚、百里香酚浓度为2、10、50、100、200μg/mL的系列混合标准工作液。

1.1.4 市售样品 混合型饲料香味剂S1（Ⅰ型，批号：20170801）、S2（Ⅱ型，批号：20170801）、S3（批号：17102701）、S4 （批号：20171031）、S5 （Ⅰ型，批号：251170320）、S6（Ⅱ型，批号：20170501）、S7（批号：20180301）。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件 Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱（粒度为 5μm，柱长 250mm，内径 4.6mm）；流速为1.0 mL/min；进样体积20μL；柱温30℃。

1.2.2 检测波长的选择 取肉桂醛、丁香酚、香芹酚、百里香酚的混合标准工作液，按上述色谱条件上机测定，进行全波长扫描，结果显示肉桂醛、丁香酚、香芹酚、百里香酚分别在290、280、275、275 nm处有最大吸收波长。在三种波长条件下，肉桂醛的响应约是其他三种物质的10倍，丁香酚的响应略大于香芹酚和百里香酚，考虑到香芹酚和百里香酚响应小，出峰时间晚，选择275 nm作为检测波长，见图1。

图1 标准溶液色谱图

1.2.3 流动相的筛选 本实验采用甲醇∶水∶冰醋酸（60∶40∶2）和不同比例的乙腈和水作为流动相进行研究，结果显示，采用甲醇∶水∶冰醋酸（60∶40∶2）作为流动相时，肉桂醛的测定有杂质干扰，无法分离，采用乙腈和水可以将杂质峰与肉桂醛分离，随着乙腈含量提高，检测时间缩短，香芹酚和百里香酚的分离度也逐渐缩小，最后选择了乙腈∶水（45∶55）作为流动相，使 4个有效成分得到较好的分离，分离度R≥2.3。

1.2.4 样品提取方法的筛选 肉桂醛、丁香酚、香芹酚、百里香酚均易溶于甲醇，因此采用甲醇进行提取。取五个不同厂家的市售样品，分别采用10、20、30min进行超声提取，结果表明在超声20min后，有效成分的提取效果不再变化，故选择甲醇超声提取20min为样品提取方法。

2 结果

2.1 标准曲线线性关系 取肉桂醛标准储备液适量， 用甲醇配制成浓度为 0.2、1、5、10、20 μg/mL；取丁香酚、香芹酚、百里香酚标准储备液适量，用甲醇配制浓度为 2、10、50、100、200 μg/mL 的混合标准溶液，按拟定的色谱条件下进行测定。结果4个有效成分在两个数量级浓度范围内线性关系良好（r≥0.9997），线性最低浓度的信噪比均大于 45（表 1）。

表1 肉桂醛、丁香酚、香芹酚、百里香酚的线性关系

2.2 准确度和精密度

2.2.1 空白载体加标回收率实验和精密度 饲料香味剂常用的载体为二氧化硅，故本实验采用在二氧化硅中添加3个不同浓度水平的4种香味剂混合标准溶液，按照1.2.4中方法进行处理和拟定的色谱条件测定，结果4种香味剂的加标回收率为 96.8% ～ 102.7%，RSD≤2.0%（表 2）。

表2 空白载体加标回收率实验和精密度

2.2.2 样品加标回收率实验和精密度 选取市售样品S1，平行称取5份，向样品中加入3个质量浓度的4种香味剂混合标准溶液，考察实际样品中的加标回收率和精密度，结果实际样品的加标回收率为95.0%～102.6%，RSD为0.5% ～1.4%，回收率和精密度均符合要求（表3）。

表3 实际样品的回收率和精密度实验

2.3 样品测定 精密称取S1～S7样品0.2～2 g（精确至0.0001 g），置于50mL容量瓶中，加甲醇超声提取20 min，定容，摇匀，精密量取适量，用甲醇稀释至浓度在标准曲线范围内，过0.45μm滤膜，按拟定色谱条件测定，以保留时间定性，标准曲线外标法定量。结果显示，市售产品均含有2种或2种以上香味剂，有效成分分离良好，无杂质干扰，含量为2% ～40%（表4）。

3 结论

本研究建立了同时测定饲料香味剂中肉桂醛、丁香酚、香芹酚和百里香酚的高效液相色谱法，并对色谱条件、样品前处理方法进行了优化。实验结果显示，4种香味剂在25 min内实现基线分离，所建立的方法操作简便，方法专属性强，线性范围宽，准确度和精密度符合相关要求。

表4 市售样品的检测结果%

参考文献

[1]董茂峰，韩薇，白冰，等.气相色谱法测定饲料香味剂中香芹酚和百里香酚的含量[J].上海农业学报，2015，31（3）：79 ～ 81.

[2]李会荣，宫玲玲.利用气相色谱法同步测定饲料香味剂中麝香草酚，丁香酚和香兰素的研究[J].中国饲料，2017，14：36～38.

[3]李京晶.香辛料植物挥发油有效成分测定及其抗菌活性研究：[硕士学位论文][D].北京：中国农业大学，2006.

[4]吕继蓉，曾凡坤，张克英，等.猪乳香味剂对断奶仔猪采食行为和采食量的影响[J].动物营养学报，2011，23（5）：848 ～ 853.

[5]杨晶晶.不同复合成分香味剂对断奶仔猪偏食性及应用效果研究：[硕士学位论文][D].沈阳：沈阳农业大学，2016.

[6]杨希国，李永才.高效液相色谱法测定饲料香味剂中香芹酚和百里香酚含量的研究[J].中国饲料，2010，1：37～38.